РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика обстежених студентів
Обстежено дві групи студентів І-ІІІ курсів Львівського національного
університету імені Івана Франка, студенти першої з яких займалися Хатха-Йогою,
студенти другої групи займалися фізичним вихованням за державною програмою. Усі
студенти були практично здорові, порушень ОМЦ у студенток не спостерігалось.
2.2. Організація дослідження
Матеріалом для досліджень є плазма крові.
Дослідження проведено протягом 1996-2000 рр. у два етапи. На першому етапі, що
тривав протягом 1997 року, досліджено вплив окремих асан Хатха-Йоги на вміст
гормонів щитоподібної залози (Т3, Т4), надниркових (CORT) і статевих (TEST,
ESTR, PROG) залоз у плазмі крові. В осіб чоловічої статі визначали гормони Т3,
Т4, CORT, TEST; в осіб жіночої статі – Т3, Т4, CORT, ESTR, PROG. В осіб жіночої
статі, які брали участь у дослідженні, забір крові проводився постійно під час
постовуляторної фази ОМЦ, яку визначали зі слів обстежуваної, що пізніше
підтверджувалося результатом аналізу вмісту ESTR i PROG у крові. Тривалість ОМЦ
у обстежених студенток 27-32 дні. Досліджено асани: пози Плуга, Лотоса, Свічки,
Напівсвічки, Героя, Змії. Кожну асану утримували по 10 хв. Забір крові з
ліктьової вени проводився до та після виконання асани.
На другому етапі досліджень, що тривав у 1999-2000 рр., досліджували вплив
тривалих занять Хатха-Йогою (1 рік) на вміст тих самих гормонів у плазмі крові.
Одночасно визначали й супутні зміни таких функціональних показників:
електроліти крові Na+, K+, Ca2+, вміст МДА як показник ПОЛ. Аналізи
концентрації гормонів проводили у Лабораторії радіоізотопної діагностики
Львівської обласної клінічної лікарні. Забір крові робили натщесерце з 9 до 10
год ранку.
2.3. Методи дослідження
2.3.1. Радіоімунологічні методи визначення гормонів у крові
Принцип методу
Радіоімунологічне визначення вмісту гормонів у плазмі або сироватці крові – це
конкурентний імунохімічний аналіз. Ці методи найчастіше мають на увазі в
англійській науковій літературі при вживанні терміну “radioimmunoassay” (RIA).
Дослідник користується антигеном, ідентичним тому, котрий підлягає визначенню в
пробі, і антисироваткою до цього антигену. Підбирають таке співвідношення між
ними, щоб в імунній реакції радіоактивно мічений антиген виявлявся у надлишку,
так що його антисироватка зв’язує лише частину його стандартної вихідної
кількості (50-80 %). Частка зв’язування визначається після видалення імунних
комплексів з розчину (шляхом преципітації, фільтрування чи сорбції) за
співвідношенням радіоактивностей – початкової і зв’язаної з комплексом (чи тої,
що залишилася у розчині). Потім у серії попередніх експериментів до описаної
вище стандартної вихідної суміші додають відомі, зростаючі кількості чистого
неміченого антигену. Між міченими і неміченими молекулами антигену виникає
конкуренція за антитіла, що знаходяться у нестачі. В результаті цього мічені
антигени у складі імунних комплексів розбавляються неміченими і відповідно
знижується частка радіоактивності, що виводиться цими комплексами з
стандартного розчину.
Таким чином, можна побудувати калібрувальну криву, де на осі абсцис відкладають
кількість (або концентрацію) внесеного “холодного” антигену, зазвичай у
логарифмічному масштабі, а по осі ординат – частку вихідної радіоактивності (у
відсотках), що зв’язується в імунному комплексі (чи залишається у розчині).
Тепер для визначення вмісту даного антигену у досліджуваному препараті
достатньо додати відомий об’єм останнього до тої ж стандартної суміші
радіоактивного антигену і антисироватки, відділити імунні комплекси від розчину
і прорахувати радіоактивності. Знаючи частку зв’язаної радіоактивності за
калібрувальною кривою легко визначити абсолютну кількість даного антигену в
пробі [87, 138].
Радіоімунологічне визначення трийодтироніну
Визначення цього гормону проводили з допомогою набору реактивiв TOTAL
TRIIODOTHYRONINE (TT3) RIA виробництва фірми A Coulter Company (Чехія), який
призначений для кількісного визначення Т3 у сироватці або плазмі кровi людини
за настановою до його визначення [209].
Склад набору: 125I-мічений Т3, 1 флакон (55 мл), активнiсть менше 110 кБк
(лiофiлiзований препарат); 6 стандартних проб сироватки кровi, що мiстять 0;
0,5; 1; 2; 4; 12 нмоль/л Т3, 6 флаконiв (лiофiлiзованi препарати); 100 пробірок
з імобілізованими моноклональними антитілами; контрольні взірці, 2 флакони (0,5
мл).
Використовували наступні прилади i матеріали:
1. Точна мікропіпетка (50 мкл); 2. Напівавтоматична піпетка (500 мкл); 3.
г-лічильник; 4. вортекс; 5. шейкер більше ніж на 280 струшувань/хв; 6. вакуумна
помпа.
Для підготовки реагентiв кров переносили в пробірки з гепарином чи ЕДТА,
відділяли плазму. Взірці плазми можуть зберігатися при 2-8 °C протягом 24 год,
а заморожені при -20 °С – до 6 місяців.
Процедура аналізу:
Схему процедури аналізу наведено у табл. 2.1. Доводили контрольні взірці до
кімнатної температури і внесли по 0,5 мл дистильованої води у флакони з
контрольними взірцями. Витримували протягом 10 хв і перемішували без утворення
піни. Розчинені контрольні взірці можуть зберігатися при 2-8 °С протягом тижня
та при -20 °С до терміну придатності набору. Готували серію пробірок у
дублікатах. Вносили відповідно по 50 мкл стандартів, контрольних проб і
досліджуваних проб у пробірки з імобілізованими антитілами. Вносили по 500 мкл
міченого Т3. Перемішували без утворення піни. Інкубували пробірки 1 год при
кімнатній температурі і постійному струшуванні (не менше 280 струшувань/хв).
Таблиця 2.1
Схема процедури аналізу
Стадія 1
Внесення реагентів
Стадія 2
Інкубація
- Київ+380960830922