Раздел 2
Методы исследования и обработки полученных результатов
Исследования выполнены на переживающих поперечных срезах дорсального гиппокампа
нелинейных белых крыс и мышей. После декапитации животных из черепа выделяли
головной мозг и помещали его в чашку Петри, заполненную солевым раствором,
охлажденным до 4 - 6°С. Здесь из мозга выделяли блок, содержащий левый и правый
дорсальный гиппокамп, и из этого блока готовили поперечные срезы толщиной 300 -
400 мкм с помощью лучкового ножа, либо с помощью вибротома. Полученные срезы
гиппокампа инкубировали в проточной камере, суперфузируя их солевым раствором
следующего ионного состава (мМ/л): NaCl - 124, KCl - 3, KH2PO4 - 1,25; NaHCO3 -
26, CaCl2 - 2, MgSO4 - 1, D-глюкоза - 10; при температуре 25°С. Солевой раствор
был предварительно насыщен газовой смесью, содержащей 95 % О2 и 5 % СО2. После
адаптации срезов к солевой среде в течение 60 - 90 мин каждый срез переносили в
рабочую камеру объемом 0,5 мл, где его суперфузировали тем же насыщенным
карбогеном солевым раствором при температуре 30°С. Скорость протока солевого
раствора в рабочей камере 1 мл/мин; рН раствора - 7,4.
С помощью стеклянных микропипеток, заполненных 2 М раствором NaCl, с
сопротивлением кончика 1 - 2 МОм в радиальном слое области СА1 внеклеточно
регистрировали пВПСП пирамидных нейронов области СА1, и в средней трети
молекулярного слоя зубчатой извилины пВПСП зернистых клеток (рис.2.1).
Фокальные потенциалы усиливали по переменному току, оцифровывали с помощью
Рисунок 2.1
Схема нейрональных полей и основных связей между ними в поперечном срезе
гиппокампа.
1 – фимбрия (бахромка); 2 – коллатерали Шаффера; 3 – слой пирамидных клеток
СА1; 4 – альвеолярные волокна; 5 – борозда гиппокампа; 6 – волокна
перфорантного пути; 7 – слой гранулярных клеток зубчатой извилины; 8 – мшистые
волокна; 9 – клеточные тела поля СА3.
Стрелки указывают ортодромное распространение возбуждения.
2 – также соответствует месту стимуляции, а 3 – месту отведения потенциалов в
нейрональной системе: коллатерали Шаффера – пирамидные нейроны поля СА1;
6 и 7 – аналогичные зоны в системе: волокна перфорантного пути – гранулярные
клетки зубчатой извилины
десятиразрядного АЦП с частотой 10 кГц, усредняли по 5-10 реализациям и
фиксировали на жестком диске персонального компьютера.
Исследуемые пВПСП вызывали электрической стимуляцией КШ в радиальном слое СА1
или МПП (рис.2.1) прямоугольными импульсами тока величиной 0,02 - 0,1 мА,
длительностью 0,1 мс, частотой 1 в 10 с, которую осуществляли с помощью
биполярных нихромовых электродов.
После того как амплитуда пВПСП пирамидных нейронов области СА1 и зернистых
клеток становилась стабильной (колебания отдельных пВПСП по амплитуде не
превышал 10%) подбирали также параметры стимуляции синаптических входов, при
которых амплитуда пВПСП исследуемых нейронов составляла 1/3-1/2 от максимальной
и фокальные потенциалы не имели в своём составе популяционных спайков.
Длительную депрессию синаптической передачи в области СА1 и зубчатой извилине
вызывали низкочастотной (2 Гц, 900 импульсов) тетанической стимуляцией КШ или
МПП (рис.2.1). Регистрировали изменения амплитуды пВПСП исследуемых нейронов
тот час и на 10й, 20й, 30й и 40й мин после прекращения низкочастотной
тетанической стимуляции синаптических входов. Изменения амплитуды пВПСП
выражали в %% по отношению к контролю, принятому за 100%. Для суждения о месте
экспрессии (пре- или постсинаптическое) ДД синаптической передачи определяли
изменения величины парного облегчения и АМРА- и НМДА-компоненты пВПСП. Парное
облегчение определяли при межимпульсном интервале 50 мс и выражали отношением
амплитуды второго пВПСП к первому в %%. АМРА-компонент пВПСП определяли,
воздействуя на срезы в течении 10 мин солевым раствором, содержащим
конкурентный блокатор НМДА рецепторов D-APV (50 мкМ); НМДА-компонент пВПСП
определяли, суперфузируя срезы в течении 10 мин солевым раствором, содержащим
конкурентный блокатор АМРА рецепторов – 6-циан-7-нитрохиноксалин-2,3-дион
(CNQX) (10 мкМ), конкурентный блокатор ГАМКА рецепторов – бикукуллин (10 мкМ) и
коагонист НМДА рецепторов – глицин (10 мкМ), причём в ряде случаев в связи со
слабой выраженностью НМДА-компонента для его более наглядного выявления
приходилось в несколько раз увеличивать интенсивность стимуляции синаптических
входов. Сравнивали величины парного облегчения и амплитуд компонентов пВПСП в
контроле и во время экспрессии ДД– на 30й мин после прекращения низкочастотной
тетанической стимуляции синаптических входов.
Депотенциацию синаптической передачи в области СА1 вызывали следующим образом.
После стабилизации амплитуды пВПСП пирамидных нейронов КШ подвергали ВЧС (100
Гц, 1 с) в результате чего развивалась ДП синаптической передачи. После того
как амплитуда потенцированных пВПСП достигала постоянного уровня (через 30-60
мин после ВЧС) КШ стимулировали в течении 15 мин частотой 1 Гц; интенсивность
НЧС была точно такой же, как и интенсивность ВЧС, индуцирующей ДП синаптической
передачи. Регистрировали амплитуду пВПСП пирамидных нейронов области СА1 каждые
10 мин после окончания НЧС КШ.
Для оценки нейрон-протективного действия исследуемых веществ от аноксического
повреждения моделировали ишемический инсульт in vitro. Для этого срезы
гиппокампа после их адаптации к солевым растворам переносили в камеру,
заполненную солевым раствором того же ионного состава, но не содержащим
кислорода и глюкозы. В этой камере отсутствовал проток солевого раствора, что
приближает экспериментальные действия к условиям реального инсульта, в отличии
от исследований, в которых инсульт воспроизводили, замещая кислород азотом в
- Київ+380960830922