РОЗДІЛ 2
Методи та матеріали
2.1. Експериментальні тварини
Дослідження проводились на ізольованих нейронах гіпокампу щурів лінії Вістар віком 14-16 діб, що утримувалися на стандартній лабораторній дієті у віварії Інститутут Фізіології ім. О.О. Богомольця. Вибір тварин такого віку пояснюється тим, що до цього терміну закінчується диференціація пірамідних нейронів гіпокампу, крім того, розвиток елементів сполучної тканини не зашкоджує легкій ферментативній обробці, що використовувалась для ізоляції поодиноких нейронів.
2.2. Гіпокамп як об'єкт досліджень
2.2.1. Гіпокамп як частина лімбічної системи
Гіпокамп - це парне сегментарне підкоркове утворення, розміщене в глибині медіобазальних відділів скроневих часток головного мозку. У філогенетичному відношенні гіпокамп є найбільш давньою областю кори. На всьому подовженні від передніх відділів переднього мозку до задніх відділів скроневих часток гіпокамп межує головним чином з мигдалеподібним комплексом і нижнім рогом бокового шлуночка. Разом із прилягаючими до нього утвореннями (зубчатою фасцією і субикулумом) гіпокамп утворює гіпокампальну формацію.
Гіпокамп являє собою високоорганізовану структуру, що має складну внутрішню організацію і включає як спеціалізовані нейрони, так і поліморфні нервові клітини, котрі розміщені у строго визначеному порядку, що дозволяє чітко виділяти в гіпокампі за морфологічними особливостями різні області, поля, шари. Основними клітинами гіпокампу є пірамідні нейрони, що мають різні типи нервових закінчень на сомі, дендритах і дендритних шипиках. Гіпокамп має певні особливості клітинної будови, багато внутрішньо- і міжгіпокампальних зв'язків, а також численні зв'язки з іншими структурами мозку. Прослідковано тісні анатомічні зв'язки гіпокампу із структурами основного лімбічного кола, з активуючою ретикулярною формацією, неспецифічними ядрами таламуса і гіпоталамусом. На відміну від інших структур, гіпокамп характеризується сегментарною організацією. Кожний сегмент являє собою морфологічну одиницю, що здатна функціонувати самостійно й незалежно від інших.
Численні аферентні і еферентні зв'язки, прямі і опосередковані корково-підкоркові зв'язки, особливості синаптичних апаратів, своєрідність клітинної будови обумовлюють поліфункціональність гіпокампу. Особлива інтегруюча роль гіпокампу пов'язана не стільки з первинною переробкою сенсорних стимулів, скільки із сприйняттям і переробкою інформації на вищих рівнях мозку. Це, перед усім, оцінкові, емоційно-мотиваційні і поведінкові функції.
До складу гіпокампу входять cіра та біла речовини, які формують декілька прошарків. За номенклатурою Блекcтеда до цих шарів входять: alveus- шар акcонів пірамідних клітин; stratum oriens- шар базальних дендритів; stratum pyramidale- шар нейронних тіл (cома); stratum radiatum- шар мало розгалужених ділянок апікальних дендритів пірамідних нейронів, а також шар макcимальної щільноcті колатералей Шафера; stratum moleculare- шар розгалужених ділянок апікальних дендритів.
У stratum pyramidale залягають тіла пірамідних нейронів, які поділяють на три зони: CА1, CА2 та CА3 (cornu Ammonis). Акcони нейронів зони CА3 дають колатералі, що формують пучок (колатералі Шафера), який утворює cинаптичний контакт із дендритами нейронів зони CА1 у шарі str. radiatum .
Пірамідні нейрони гіпокампу являють собою зручний об'єкт для модулювання трансмембранних cтрумів. Заcтоcування таких методів доcлідження як "фікcація концентраціі" та петч-кламп у конфігурації "ціла клітина" відкриває нові шляхи нейрофізіологічних досліджень .
2.2.2. Роль гіпокампа і пов'язаних з ним структур у процесах запам'ятовування і навчання
В 1973 році Т.Блісс і Т. Ломо в лабораторії П.Андерсона в Осло (Норвегія) [26] вперше показали, що нейрони гіпокампа мають саме такі пластичні здатності, котрі необхідні для процесу навчання. Так, в одному із нервових шляхів гіпокампа коротка високочастотна серія потенціалів дії викликає посилення синаптичних зв'язків цього шляху. У анестезованої тварини таке підсилення може зберігатися годинами, а у не наркотизованих тварин, що вільно пересуваються -понад добу і навіть кілька тижнів. Блісс і Ломо назвали таке підсилення довготривалою потенціацією. В подальшому було встановлено, що в різних гіпокампальних синапсах цей феномен має різні властивості.
Довготривала потенціація синаптичної передачі, або long-term potentiation (LTP), являється унікальною формою синаптичної пластичності, що присутня в більшості збуджуючих синапсів ЦНС. Переважна наявність LTP в структурах, пов'язаних з формуванням пам'яті і навчання (гіпокамп, нова кора, миндалина та ін.), призвело до припущення про зв'язок LTP з мнестичними процесами. Так як вперше LTP була описана в гіпокампі, в найбільшій мірі досліджені закономірності формування LTP на синаптичних контактах колатералей Шафера і пірамідних нейронів зони СА1 гіпокампа. Як правило, LTP- це NMDA -залежний процес, що розвивається в моносинаптичних контактах. Але, початкова точка зору про виключну роль NMDA рецепторів у цьому процесі була переглянута. Сьогодні доведено, що NMDA рецептори визначають лише індукцію і частково підтримання LTP. Відкриті також структури і синапси, в яких індукція LTP не пов'язана з активацією NMDA рецепторів.
2.2.3. Отримання зрізів гіпокампу для LTP та STP реєстрації
Дослідження проводилися на зрізах гіпокампу щурів лінії Вістар віком 19-21 днів. Після декапітації тварини, гіпокамп швидко виймали і нарізали на тонкі зрізи 200-400 мкм завтовшки у холодному розчині (С) наступного складу (у мМ): 130 NaCl, 3 KCl, 2CaCl2, 1. MgCl2, 26 NaHCO3, 15 глюкоза, 1 NaH2PO4, що безперервно насичувався газовою сумішшю 95% O2 - 5% CO2 для підтримування постійного значення pH=7.4. Після цього, зрізи переносилися в камеру для зберігання, де витримувалися 3-6 годин при кімнатній температурі (22-24oC) до того часу, як вони переносились в робочу камеру. Протягом усього періоду преінкубації та експерименту зрізи містилися в розчині (Е) такого складу (у мМ): ): 135 NaCl,
- Київ+380960830922