РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ, МОДЕЛІ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ. КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ХВОРИХ
2.1. Матеріал, моделі та методи дослідження.
Модель ад'ювантного артриту. Досліди проведені на 136 білих дорослих щурах самцях та самках масою 100-225 г. Модель АА викликали субплантарним введенням щурам 0,1 мл повного ад'юванту Фрейнда, що містив 0,5 мг вбитої шляхом кип'ятіння вакцини БЦЖ в вазеліновому маслі пополам з ланоліном. Поріг больової чутливості визначали шляхом механічного стискання ураженої кінцівки [27, 29]. Ступінь тиску реєструвалась за спеціальною шкалою видовження еластичного джгута. Об'єм кінцівки вимірювали за допомогою пристрою, описаного раніше [27, 29]. Для контролю за активністю запального процесу в плазмі крові щурів визначали вміст метаболітів оксиду азоту - нітритів та нітратів за реакцією з реактивом Гріса [10, 22], і концентрацію білку гострої фази - гаптоглобіну. Вміст гаптоглобіну визначали за його здатністю утворювати комплекси з гемоглобіном [1].
Оцінювали також показники ферокінетики та гемопоезу. Вміст гемоглобіну, кількість еритроцитів, гематокрит, середній об'єм еритроцитів (МСV) та середній вміст гемоглобіну (MCH) в еритроциті, рівень заліза та залізозв'язуючу здатність сироватки крові визначали уніфікованими методами [13]. Негемове залізо досліджувалось в гомогенаті печінки після екстракції гемового заліза органічним розчинником. Активність гемоксигенази в мікросомній фракції печінки визначали за утворенням білірубіну [6].
Щурі з АА в залежності від отримуваного лікування були розподілені на 6 груп (табл. 2.1). отримували протизапальну терапію, яка включала диклофенак натрію, метотрексат, поєднання метотрексату з диклофенаком натрію. Частина щурів, яких лікували комбінацією метотрексату з диклофенаком натрію, отримували фолієву кислоту або вітамінно-мікроелементний комплекс.
Таблиця 2.1
Розподіл експериментальних тварин по групах
№Препарати Доза Термін введенняКількість тваринЗдорові щурі на повноцінному раціоні1Контроль (без введення препаратів)--102Метотрексат0,2 мг/кг1410Диклофенак натрію2,5 мг/кг143Фолієва кислота0,2 мг/кг14104Фолієва кислота 0,2 мг/кг1410Метотрексат0,2 мг/кг14Диклофенак натрію2,5 мг/кг145Полівітамінний комплекс з фолієвою кислотою14106Полівітамінний комплекс з фолієвою кислотою1410Метотрексат0,2 мг/кг14Диклофенак натрію2,5 мг/кг14Тварини з ад'ювантним артритом (АА)1Здорові без лікування--102АА без лікування--163Диклофенак натрію2,5 мг/кг14104Метотрексат0,2 мг/кг14105Диклофенак натрію 2,5 мг/кг1410Метотрексат0,2 мг/кг146Диклофенак натрію 2,5 мг/кг1410Метотрексат0,2 мг/кг14Фолієва кислота0,2 мг/кг147Диклофенак натрію 2,5 мг/кг1410Метотрексат0,2 мг/кг14Фолієва кислота0,2 мг/кг14Ретинол, 3000 МО/кг 14Токоферол20 мг/кг 14Тіамін 5 мг/кг 14Рибофлавін 2 мг/кг14Піридоксин2 мг/кг 14Селеніт натрію, 30 мкг/кг 14 Всього тварин136
Диклофенак натрію в дозі 2,5 мг/кг вводили перорально протягом 2-х тижнів, починаючи з 14 дня після введення ад'юванта. Метотрексат вводили перорально в дозі 0,2 мг/кг з 8 по 28 день з моменту моделювання АА.
В окремих групах щурів (табл. 2.1) метотрексат (0,2 мг/кг) вводили одночасно з диклофенаком натрію (2,5 мг/кг). Частина щурів з цієї групи додатково протягом двох тижнів отримували фолієву кислоту (0,2 мг/кг), або комплекс вітамінів, що включав фолієву кислоту (0,2 мг/кг), ретинол (3000 МЕ/кг), токоферол (20 мг/кг), тіамін (5 мг/кг), рибофлавін (2 мг/кг), піридоксин (2 мг/кг) та селеніт натрію (30 мкг/кг).
Під час дослідів тварини перебували на напівсинтетичному раціоні, що забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів. Звичайні раціони віварію відрізняються нестабільністю вмісту мікро- та макронутріентів і практично виключають можливість контролювати надходження всіх нутрієнтів в організм щурів.
Використаний нами напівсинтетичний раціон був складений за рекомендаціями, викладеними в монографії "Экспериментальная витаминология" [16] і включав 20% казеїну, 65% крохмалю, 5% смальцю та 5% соняшникової олії. Дієта включала також 1% суміші вітамінів, 3% суміші солей та 1% целюлози.
Тварини, що перебували на такому раціоні, отримували в перерахунку на масу тіла в середньому 2-3 мг/кг токоферолу, 200-300 МЕ/кг ретинолу, 0,2-0,3 мг/кг тіаміну, 0,2-0,3 мг/кг рибофлавіну, 0,15-0,2 мг/кг пірідоксину, 0,05 мг/кг фолату. Надлишок цих вітамінів створювали додатковим введенням щурам, що отримували повноцінний раціон, препаратів зазначених вище вітамінів в дозах, що в 5-10 разів перевищують мінімальну добову потребу щурів в цих вітамінах. Зокрема альфа-токоферол ацетат вводили в дозі 20 мг/кг протягом 10 днів, ретинол ацетат - в дозі 3000 МО/кг протягом 10 днів, тіамінбромід - в дозі 5 мг/кг, рибофлавін - в дозі 2 мг/кг, піридоксин - 2 мг/кг, фолат 0,2 мг/кг. Враховуючи, що до складу сольовою суміші не входить такий важливий мікроелемент як селен, а вміст селену в казеїні повністю не покриває потребу тварин в ньому, ми вводили щурам селеніт натрію в дозі 30 мкг/кг. Відомо, що ця доза селеніту натрію приблизно в 5 разів перевищує добову потребу щурів в селені і не викликає токсичних явищ [5]. Статус вітамінів у щурів визначали у відповідності до відомих рекомендацій з експериментальної вітамінології [16].
Дослідження токсичності метотрексату та диклофенаку натрію для щурів і протективної дії додаткового введення мікронутрієнтів. Досліди проведені на 60 білих щурах самцях та самках з початковою вагою 100-130 г без АА. Під час дослідів тварини перебували протягом 1 місяця на напівсинтетичному раціоні, який описано вище.
В частині дослідів щурам, що отримували повноцінний раціон, перорально вводили протягом 20 днів мікронутрієнти в дозах, що в 5-10 разів перевищують мінімальну добову потребу щурів в них. Тварини отримували фолієву кислоту в дозі 0,2 мг/кг, або вітамінний комплекс у ск