РАЗДЕЛ 2
ОРГАНИЗАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Схема проведения исследований
Основные направления исследований, последовательность их решения и взаимосвязь этапов решения задачи разработки биотехнологии получения гидролитического ферментного препарата Галактолонгин Г10х, отображены в структурной схеме, представленной на рис. 2.1
Первым этапом работы стало проведение аналитических исследований, которые позволили выбрать конкретные направления эксперимента, определить последовательность ключевых этапов решения поставленной задачи.
Дальнейшие экспериментально-технологические исследования, проводившиеся по направлениям, показанным на рис. 2.1, показали целесообразность культивирования культуры Bifidobacterium longum на среде MRS с последующей дезинтеграцией клеточных структур в установленном режиме. В ходе работы были изучены и опробованы различные методы очистки ферментного препарата. На заключительном этапе исследований изучено влияние физико-химических показателей на активность ферментного препарата, проведена промышленная апробация разработанной технологии получения гидролитического ферментного препарата Галактолонгин Г10х.
Проведенные аналитические и экспериментально-теоретические исследования позволили разработать производственно-технологическую схему получения гидролитического ферментного препарата Галактолонгин Г10х и оптимизировать технологические параметры разработанных процессов с использованием методов математического планирования эксперимента.
2.2. Объекты исследований
В качестве объектов исследований в работе использовали:
* культуры бифидобактерий Bifidobacterium longum ЛМ-6, Bifidobacterium adolescentis ЛМ-21, Bifidobacterium bifidum ЛМ-19, Saccharomyces cerevisiae К-14;
* питательные среды соевая сыворотка, кукурузно-лактозная, Блаурокка, MRS;
* соевое молоко сухое (ТУ У 6170021.55-99), полученное на Ахтырском сыркомбинате (Сумская область, Украина).
2.3. Организация и методы исследований
Основная часть исследований была проведена в лабораториях кафедры биохимии и микробиологии ОНАПТ, отдельные исследования выполнялись в лаборатории биохимии СГИ. Промышленную апробацию и выпуск опытной партии гидролитического ферментного препарата Галактолонгин Г10х проводили на предприятии по производству улучшителей муки на основе ферментных композиций СП Украинско-Турецкое "ЧП Карат". Описание биохимических, химических и физико-химических методов исследований в соответствии с направлениями проводившихся экспериментов приведено в табл. 2.1. Оригинальные подробно изложены ниже в настоящем разделе.
Таблица 2.1.
Методы исследований, используемые при проведении экспериментов
№ ппПоказатели и методы исследованийПринцип метода, спецификаИсточник1234
Редуцирующие веществаМетодом Хагедорна-Иенсена
[136]
2Качественное и количественное исследование углеводного составаПроводили методом тонкослойной хроматографии
[122-124]
3Определение активности ферментаАктивность определяли по методу Church
(1980) г
[129]
4
Определение оптимального значения pHЭффект pH на активность фермента определяли в цитратном буфере с диапозонм значений pH от 3,6 до 7,6
[129]
Определение оптимальной температурыВлияние температуры на активность фермента определяли инкубированием исследуемой смеси в течение 15 мин при температуре от 25 до
70 °С
[129]
6Идентификация каталитически активных групп ?-галактозидазыПроводили путём определения величины рК (Зависимость активности фермента от рН)
[102]
7Определение теплот ионизации каталитически активных групп
?-галактозидазыТеплоты ионизации карбоксильных и имидазольных групп рассчитывали по уравнению Вант-Гоффа
[131]
8Идентификация имидазольной группы
?-галактозидазыПроводили путём фотоинактивации окислением имидазольной группы
[106]
Культивирование культур бифидобактерий глубинным методом
Культуры выращивали на следующих средах: кукурузно-лактозная среда, среда Блаурокка, среда MRS, соевая сыворотка.
Соевую сыворотку получали коагуляцией белков соевого молока уксусной кислотой. Она содержит (г/л): белков 11; углеводов 7,7; кальция 0,54; железа 0,23.
Состав среды кукурузно-лактозной на 1 л: пептон- 10 г, лактоза- 10 г, кукурузный экстракт- 60 мл, цистеин- 0,2 г, аскорбиновая кислота- 0,5 г, Na-цитрат- 6 г, MgSO4-- 0,12 г, Na2HPO4- 1 г, KH2PO4- 2 г, дистиллированной водой довести до 1 л.
Состав среды Блаурокка на 1 л печёночного отвара: пептон 1%- 5 г, NaCl- 0,5-2,5 г, лактоза 1 %- 5 г, агар-агар-355 мг, цистеин солянокислый- 50 мг.
Все компоненты растворяли в небольшом количестве среды, агар-агар расплавляли, потом всё смешивали.
Состав среды MRS на 1 л: мясной экстракт- 10 г, пептон из казеина- 10 г, дрожжевой экстракт- 5 г, двузамещённый фосфат калия- 2 г, цитрат аммония- 2 г, ?-глюкоза- 20 г, твин 80- 1 г, ацетат Na- 5 г, MgSO4-- 0,2 г , Mn SO4- 0,05 г, агар- 9-18 г.
Культивирование микроорганизмов осуществляли при температуре (38?1)?С в течение 24 часов. Оценку биотехнологических свойств штаммов проводили по показателям: численность клеток (Lg KOE), удельная скорость роста (?, час-1).
Удельная скорость роста- как увеличение количества бактерий в единицу времени:
lg x - lg x0
?= ------ ,
lg e * (t - t0)
где x, x0- концентрация биомассы в момент времени t и t0,
lg e = 0,43429.
Получение углеводного индуктора биосинтеза ?-галактозидазы
Водный соевый экстракт (соевое молоко) нагревали на водяной бане при t=95 °С в течение 10 мин, затем его подвергали центрифугированию 6000 мин-1, 20 мин. Образовавшийся в результате центрифугирования осадок удаляли, а к фугату добавляли двойное количество этанола и данная смесь подвергалась вакуум-выпариванию до исходного объёма. pH смеси доводили до 5,5 и вносили дрожжевую культуру S.cerevisiae, в термостаттировали при t=37