ГЛАВА 2
ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.1.1. Почва.
Исследования проводили на легкосуглинистой темно-серой оподзоленной почве, отобранной на опытном поле Национального аграрного университета (НАУ, г. Киев) на глубине 20 см от поверхности. Эта почва, наиболее характерная для лесо-степной зоны Украины, по данным докт.с.-х. наук, проф. А.Д. Балаева (кафедра почвоведения НАУ) имела следующие показатели: рН - 5,8; емкость катионного обмена - 18,0 мг-экв/100г; карбонаты - 0,002%; органический углерод - 2,6%.
2.1.2. Микроорганизмы.
Для микробиологической обработки почвы были выбраны металлорезистентные культуры Bacillus cereus BKM 4368 из музея микробных культур Института биоколлоидной химии НАН Украины и Alcaligenes eutrophus CH34, любезно предоставленная специалистами центра "VITO" (Бельгия). Эти культуры были выделены из почв, загрязненных тяжелыми металлами, и характеризовались высокой металлорезистентностью: пороги чувствительности для меди, кобальта, никеля, цинка составляли ?3мМ [38], урана (VI) ? 1мМ [83]. Культура гетеротрофа B. cereus BKM 4368, по нашим данным - Грам положительная, спорообразующая с палочковидными клетками, непатогенна и генетически стабильна, способна утилизировать широкий спектр источников углерода: полипептиды, сахарозу, глюкозу, крахмал, маннит, сорбит, ксилозу, метанол, этанол. Культура A.eutrophus CH34 - Грам отрицательный факультативный хемолитротроф с палочковидыми клетками, не образует спор, способна хорошо расти на смеси водорода и углекислого газа, глюконате, ацетате, сукцинате, бензоате, гистидине, плохо - на спиртах глицероле и этаноле [42].
2.1.3. Среды.
Для обеспечения развития металлорезистентных культур бактерий в присутствии тяжелых металлов была использована базовая минимальная среда, разработанная [43] для A.eutrophus CH 34, имеющая состав (г/дм3): трис - 6,06; NaCl - 4,68; KCl - 1,49; NH4Cl - 1,07; Na2SO4 - 0,43; MgCl2 ? 6H2O - 0,20; CaCl2 ? 2H2O - 0,03; Na2HPO4 ? 12H2O - 0,23; источник углерода - 8,0. Используемая среда содержит макроэлементы в количествах, необходимых для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов (без избытка), и трис-НCl систему (оксиметиламинометан) для предотвращения преципитации тяжелых металлов в исходном растворе. В описанную солевую среду добавляли в качестве источника углерода ацетат натрия, способный активно ассимилироваться обеими тест-культурами и глюкозу либо сахарозу в вариантах опытов с бациллами. В некоторых опытах источником биогенных элементов для микроорганизмов была разведенная в три раза вода сахарного производства с рН 6,3-6,8, которая содержала азот (100 мг/дм3), фосфор (100 мг/дм3 P2O5), углеводы (30 г/дм3). Биомасса обеих металлорезистентных бактерий для обработки почвы накапливалась также на мясо-пептонном бульоне, разведенном 0,56 %-м раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 2. При определении концентрации микроорганизмов были использованы агаризованные плотные питательные среды - мясо-пептонный и крахмало-аммиачный агары.
2.1.4. Тест-металлы.
Для загрязнения почвы использовали CuCl2 ? 6H2O, CoCl2 ? 6H2O, Sr(NO3)2 ? 6H2O и UO2(NO3)2 ? 6H2O, содержащий радиоактивный уран U-238. Все соли имели квалификацию "х. ч." или "ч.д.а".
Органокомплексы тяжелых металлов Ca, Mg, Sr, Fe(III), Zn, Cu, Ni, Co, U(VI) - цитратные и фульватные комплексы - были синтезированы путем перемешивания растворов соответствующих хлоридов или нитратов в течение 2 суток с растворами лимонной или фульвиновой кислот при мольном соотношении 1 : 1 или 1 : 5 соответственно. Сухие препараты фульвиновой кислоты были предоставлены академиком НАН Беларуси И.И. Лиштваном (Институт торфа, Беларусь).
2.2. Методы исследования
2.2.1. Подготовка почвы.
Природную оподзоленную почву измельчали, освобождали от растительных остатков, контаминировали растворами тяжелых металлов (индивидуальными или смешанными) при перемешивании, осаждали из раствора (центрифугированием или отстаиванием), высушивали на воздухе. В суспензионных опытах природную почву перемешивали на стационарной качалке (320 об./мин) с растворами солей тяжелых металлов в течение 18 ч (до установления сорбционного равновесия), осаждали почву центрифугированием (13.600 g, t=5мин). В стационарном (колоночном) варианте опытов почву помещали в пластмассовые колонки (d=15 см, h=20 см) с окончанием на конус с отверстием, закрывающимся крышкой, через которое можно производить слив жидкости (при проведении процедур контаминации, промывания).
Удельную сорбцию тяжелых металлов почвой или микробными клетками определяли по разнице между исходной и остаточной концентрациями металлов (в супернатанте) в пересчете на 1 г почвы.
2.2.2. Методы выщелачивания тяжелых металлов.
Выщелачивание тяжелых металлов/радионуклидов из почвы проводили в суспензионном варианте в минимальной синтетической среде, без триса, но с источником углерода, инокулированной клетками из расчета 107 клеток в 1 мл при соотношении Т : Ж=1 : 10. Такое соотношение обычно применяется в суспензионном варианте биовыщелачивания руд [52]. Для интенсификации массобменных процессов биовыщелачивание металлов из почвы проводили в колбах Эрленмейера в аэробных условиях при перемешивании на качалке (320 об./мин) и температуре 220С. По окончании процесса выщелачивания (определялось по стабилизации величины рН раствора) почвенные суспензии перемещали из колб в цилиндры, отстаивали, декантировали надосадочную жидкость и анализировали в ней концентрацию тяжелых металлов. Эффективность биовыщелачивания определяли по формуле:
,
где Сi - исходная концентрация металла в почве; Се - то же в жидкой фазе после очистки. Оценивали также скорость осаждения почвы из столба суспензии по формуле:
,
где V - объем осветленного слоя жидкости над осадком почвы (см3), t - время осаждения (ч).
В колоночном варианте клетки вносили в почву в виде суспензии в м