РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Принцип відбору досліджуваних фізіологічно активних речовин (ФАР)
Для вирішення поставлених задач були відібрані відомі хімічні сполуки, які регулюють активність різних ланок мембранних сигнальних систем і їх функціональна активність досліджувалась на фоні опромінення малими дозами радіації (табл.2.1.)
Таблиця 2.1
Досліджувані фізіологічно активні речовини
Назва
Речовини
ФормулаОсновний механізм дії
Адреналін
Агоніст
?-адренорецепторів
10-5 - 10-11М [126-131]
Теофілін
Агоніст А1-аденозинових рецепторів
5·10-4 - 10-5 М
[132-133]продовження табл. 2.1
Ізопреналін
Активатор ?-адренорецепторів
10-3, 10-5 -10-11 М
[126, 131, 134 -136]
Йохимбін
Блокатор ?2-адренорецепторів
10-5 - 10-7 М
[137 -138]
Пропранолол
Антагоніст ?-адренорецепторів
10-6 - 10-7 М
[127, 137]
Дибутирил-цАМФАналог цАМФ
10-4 - 4·10-6 , 0,5·10-6 М
[132, 139]продовження табл. 2.1
Пероксид водню
H2O2
Активатор протеїнкінази С і ФЛА2
(0,1 - 1,0)?10-3 М
[140-142]
Форсколін
Активатор аденілатциклази
10-4 - 10-6 М
[133 - 134, 143-147]BW-755CІнгібітор
ліпо-і циклооксигенази
10-4 -10-5 М
[148-149]АспіринІнгібітор
циклооксигенази
10-4 М [149]ХінакринІнгібітор фосфоліпази А2
1?10-4 - 1?10-5 М
[150, 151]2.2. Метод клітинного електрофорезу
Метод використовувався з низкою модифікацій і включав два основних етапи: виділення поліморфноядерних лейкоцитів та еритроцитів і, власне, визначення електрофоретичної рухливості клітин (ЕФР). Даний метод широко використовувався для дослідження зв?язку поверхневого заряду мембрани з функціонуванням клітинних сигнальних каскадів. В роботах [152-157] показано, що метод клітинного електрофорезу дозволяє вивчити мікроелектрофоретичні властивості поверхневого заряду клітин крові та його залежність від функціонального стану клітин. Дослідження [153] показали, що генерація мембранного потенціалу здійснюється за рахунок активації Са2+- поліфосфоінозитидного каскаду та гальмування аденілатциклазної системи.
2.2.1. Виділення клітин
Об'єктом дослідження були еритроцити і поліморфноядерні лейкоцити крові людини та спленоцити щурів. Ці клітини є найбільш адекватним об'єктом дослідження властивостей поверхні мембрани, так як в процесі їх виділення не використовуються протеолітичні ферменти, які, в тій чи іншій мірі, змінюють структурно-функціональний стан плазматичної мембрани.
Поліморфноядерні лейкоцити виділяли з цільної крові здорових людей за допомогою центрифугування (40 хв., 1500 об./хв., при t=20?С ± 2?С) в градієнті щільності фікол-верографін (щільність 0,095 г/см3) [158].
В результаті центрифугування поліморфноядерні лейкоцити осідали у шарі верографін-фікол, їх відбирали пастерівською піпеткою і додавали до суспензуючого розчину, який у подальшому використовувався як електрофоретичне середовище. Потім суспензію клітин тричі відмивали в фізіологічному розчині протягом 10 хв. при 1500 об/хв. На кінцевому етапі ПМЯЛ одержували із центрифужного осаду після лізису еритроцитів і двократного відмивання клітин у суспензуючому розчині.
Лімфоцити, які використовувалися для дослідження, були отримані із селезінки мишей методом [159].
Життєздатність клітин оцінювали за відсутністю забарвлення еозином (0,1% розчин барвника в суспензуючому розчині). У всіх випадках відсоток клітин був не більше 3-5%.
Еритроцити виділяли з цільної крові шляхом осаджування на желатині та подальшим центрифугуванням у робочому електрофоретичному розчині.
2.2.2. Опромінення клітин та вимірювання електрофоретичної рухливості методом мікроелектрофорезу
Клітинний електрофорез еритроцитів та лейкоцитів проводили при кімнатній температурі після їх інкубації з радіонуклідом. Опромінення здійснювали внесенням в середовище інкубації радіоактивного ізотопу 90Sr у концентраціях 1,2? 10-10 -1,2 ?10-6 Кі/л та 14С в концентраціях 1?10-9 - 1?10-3 Кі/л. Час інкубації клітинної суспензії з радіоактивною речовиною становив 1 годину при кімнатній температурі. Концентрація лейкоцитів у середовищі інкубації становила ~105 клітин/мл. Концентрація еритроцитів - 106 клітин/мл. Поглинені дози випромінювання розраховувалися згідно Lovenger R за формулою (2), [160]:
Ді = 21,3·E? ·Ct ·t, (2), [160]
Де Ді - поглинена доза за час t (Гр);
Е?-cередня енергія випромінення радіонукліда за 1 розпад (MеВ);
Ct - концентрація радіонукліда (Кі/л);
t - час експозиції клітин з радіонуклідом (год.);
21,3 - коефіцієнт перерахування радіоактивних одиниць (Кі/л) в одиниці поглиненої дози (Гр).
Принцип методу мікроелектрофорезу полягає у вимірюванні швидкості переміщення окремих клітин в електричному полі у спеціальній комірці [13, 161], але метод, який ми використовували відрізняється рядом модифікацій [162].
Основна частина пристрою для мікроелектрофорезу (рис. 2.1.), становить собою скляну циліндричну трубку діаметром 1,5 мм та довжиною 120 мм із прямокутним отвором у верхній частині розміром 1,5 х18 мм.
Рис. 2.1. Схема мікроелектрофоретичної установки
1- подвійний ключ;
2- мікроскоп;
3- електрофоретична камера;
4- скляні електроди;
5- хлор-срібні електроди.
До кінців камери підведені агарові стовпчики, довжиною 40-50 мм, що відділяють її від електродних відсіків, щоб продукти електролізу не контактували з клітинною сумішшю. У роботі використовувалися хлор-срібні електроди. В якості джерела струму використовували стандартний УІП-2. Комірку поміщали на предметний столик мікроскопа МБИ-12, нагріваючу дію світла усували за допомогою спеціального фільтра теплового випромінювання. Усі виміри проводили при кімнатній температурі (21±2?С). Швидкість руху клітин вимірювали у нижньому стаціонарному шарі, який у циліндричній камері розташований на відстані r=0,145d вище її дна (d - внутрішній діаметр камери).
Для визначення швидкості руху вимірювали час пробігу клітиною певної дистанції (50-100мкм) з