Розділ 2). Для
інактивації SA-11 була розроблена методика, яка включала в себе наступні
процедури:
1. Солюбілізацію неочищеної вірусвмістної культуральної рідини неіонним
детергентом Тритоном Х-100 в діапазоні рН 7,4-7,6 впродовж 15 хв при 37оС;
2. Внесення сполуки цис-хлородіамінплатини із ДНК (МКП) у вигляді
цитратно-сольового розчину із вмістом основної речовини в межах 5,2-6,4 г/дм3 і
вмістом платини 2,0-2,2 г/дм3. МКП одержували в результаті хімічної взаємодії
цис-дихлородіамінплатини (ІІ) з ДНК із селезінки телят, молекулярна маса якої
була не меньшою, ніж 7 ·106 Д.
3. Інкубація впродовж 90 хв при температурі 37оС;
4. Освітлювання культуральної рідини центрифугуванням при 3000 об/хв впродовж
10 хв.
5. Визначення залишкової інфекційної активності РВ.
Проведення процедури інактивації за таких умов призводило до повної інактивації
РВ штаму SA-11. Динаміка інактивації РВ SA-11 представлена на рис. 3.11.
Рис.3.11. Динаміка інактивації ротавірусу SA-11 за допомогою МКП
Встановлено, що впродовж 90 хв інкубації при 37оС МКП в присутності неіонного
детергента повністю інактивує РВ SA-11. В загальному вигляді наближена крива
інактивації SA-11 відповідала експоненційній функції в часі
(y=e-kt).
На графіку динаміки інактивації РВ можна вирізнити три ділянки, що відповідають
етапам інактивації. На першому етапі інфекційна активність вірусу зменьшується
на 8-10 % впродовж перших 15 хв після додавання до вірусвмісної рідини Тритону
Х-100. Потім у момент додавання МКП інфекційна активність зразу падала ще на
12-20 % в порівнянні з її попереднім значенням. Впродовж наступних 15 хв.
інкубації з МКП при температурі 37оС інфекційна активність вірусів
зменьшувалась ще на 40-45 %. За решту часу (75 хв.), в повільній фазі
інактивації, інфекційна активність РВ зменьшувалась ще приблизно на 25-30 %,
досягаючи граничних значень повної інактивації РВ.
Аналогічні результати були отримані при перевірці цієї методики на штамах РВ
HRV-134, “К”, “Тіверваль”.
При порівнянні кривих інактивації всіх 4-х досліджених штамів РВ нами було
встановлено, що наближені криві інактивації у всіх випадках практично
співпадали, на кожній з них можна було спостерігати чітко виражену трьох-
фазність процесу інактивації.
Для вивчення інтерфероногенної активності інактивованих РВ нами був відібраний
в попередніх дослідженнях РВ мавп штам SA-11, який проявляв найвищі
інтерфероногенні властивості.
Миши були поділені на 4 групи. Мишам першої групи вводили інфекційно активний
РВ SA-11, другої – РВ SA-11, інактивований МКП, третьої – розчин МКП у
концентрації, що присутня у препараті інактивованого РВ. Тваринам четвертої
групи вводили фізіологічний розчин (плацебо). Всього було використано 80 мишей
(по 20 тварин в кожній групі).
Мишам першої групи вводили РВ SA-11 в дозі 105ТЦД50/мл. Мишам другої групи
вводили РВ, інактивований МКП (вміст МКП 5800 мкг/кг, або 116 мкг/мишу), мишам
третьої групи вводили тільки МКП у вищезазначеній концентрації (5800 мкг/кг або
116 мкг/мишу), мишам четвертої групи вводили фізіологічний розчин. В усіх
випадках об’єм введення матеріалу складав 0,4 мл.
Інтерфероногенну дію інфекційно активного РВ, РВ, інактивованого МКП, а також
самого МКП вивчали в динаміці через 2, 4, 8, 12 і 24 години після їх введення.
ІФН сироватки крові титрували в культурі клітин L-929 мікрометодом.
Визначено, що в організмі досліджуваних мишей перших трьох груп через 2 години
з’являється, а потім зростає рівень ендогенного ІФН в сироватці крові. В крові
мишей четвертої групи, яким вводили фізіологічний розчин, ІФН в сироватці крові
не визначався.
Рівень ендогенного ІФН в організмі мишей перших трьох груп в динаміці
представлено на рис. 3.12.
Рис. 3.12. Рівень ендогенного ІФН в організмі мишей
Встановлено, що інтерфероногенна активність інактивованого вірусу була у 100
разів вищою у порівняння з інфекційно активним вірусом. Розрахунок ПАІ
проведений в ціх дослідженнях показав високу активність інактивованого РВ, як
індуктора інтерфероноутворення (ПАІ = 5800 мкг/кг : 64000 Од/мл= 0,091).
Таким чином, інтерфероніндукуюча потенція інактивованого МКП РВ штаму SA-11
характеризує його як сильний інтерфероноген або як сильний індуктор
інтерфероноутворення.
3.3. Порівняльний аналіз інтерфероногенних властивостей інфекційно активного
та інактивованого МКП ротавірусу SA-11 з відомими індукторами
інтерферону
На завершальному етапі ми провели порівняльний аналіз інтерфероногенних
властивостей інфекційно активного та інактивованого РВ з аналогічними
властивостями відомих індукторів ІФН. Для цього нами були відібрані полігуацил,
пірогенал, інфекційно активні ВХН та вірус поліомієліту ІІ типу. ВХН
використовували в дозі 106ТЦД50/мл, а поліовірус в дозі 108ТЦД50/мл, які
вводили мишам в об’ємі 0,4 мл внутрішньочеревно. Полігуацил вводили мишам із
розрахунку 5,0 мкг/кг або 0,10 мкг/мишу. Бактеріальний ліпополісахарид –
пірогенал, вводили із розрахунку 8,3 мкг/кг або 0,16 мкг/мишу. Вищезазначені
концентрації були відпрацьовані раніше.
В роботі були використані 80 мишей, які були поділені на 4 групи, видповідно до
кількості використаних індукторів порівняння. На кожну інтерфероніндукуючу
мінімальну дозу використовували по 20 мишей. Відбір крові здійснювали у
відповідності з вищезазначеною методикою.
Встановлено, що полігуацил індукує ІФН в сироватці крові мишей в титрах 1:16
000- 1:32 000 Од/мл, пірогенал – 1:320-1:640 Од/мл, ВХН - 1:16 000- 1:32 000
Од/мл, вірус поліомієліту – 1:80-1:160 Од/мл.
Розрахунок ПАІ для полігуацилу, проведений за