РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методичний підхід до дослідження функціонування Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна
Для досліджень функціонування Са2+-транспортувальних систем використовували слинні залози личинки комара-дергуна (Chironomus plumosus Linnaeus, 1758.). Цей вид зустрічається широко у природі в основному у помірному поясі, добре вивчений зоологами і ентомологами, належить до роду Chironomus Meigen (1803), родини Chironomidae Macquar (1838), ряду Diptera, класу Insecta. Личинка має яскраво-червоне забарвлення (рис. 2.1 А) за рахунок наявності у гемолімфі гемоглобіну, який становить 90-95% від загального вмісту білка у ній [166], добре розвинену голову, 3 грудних і 10 черевних сегментів, з яких перший грудний і останній черевний містять псевдоніжки.
Слинні залози личинок розміщені у ІІ-ІІІ грудних сегментах з боків від стравоходу. Вони утворені одношаровим епiтелiєм, який обмежує внутрішню секреторну порожнину, мають вигляд овального сплющеного мiшечка у формі рукавички з невеликими лопатями на нижньому і верхньому його краях (рис. 2.1 Б). Розрізняють верхню, основну, нижню, бокову і передню частки [7]. Залоза вільно фіксується у порожнині тіла за допомогою зв'язок, які прикріплені до нижньої та верхньої часток. Вивідна протока, що міститься між передньою та верхньою частками, відходить від залози і закінчується на дні гіпофаринкса. Згідно класифікації Заварзіна [6] ці залози вiдносять до групи малоклiтинних, тобто вони є популяцією клітин, що знаходяться у структурному і хімічному взаємозв'язку та спеціалізовані у різних напрямках.
Кількість секреторних клітин у залозі личинки постійна (38-48 клітин) з моменту її вилуплення і до настання метаморфозу, тому збільшення розмірів залози обумовлене не поділом клітин, а виключно їх ростом. Перед перетворенням у лялечку слинні залози личинки досягають максимальних розмірів (2 мм у довжину та 0,8 мм шириною). Внаслідок послiдовних (до 15) ендомiтозiв утворюються дуже великі клітини з ядрами, що мiстять високополiтеннi хромосоми.
Будова секреторних клітин слинної залози підпорядковується їхній головній функції, яка полягає як у транспорті речовин із гемолімфи у внутрішню порожнину, так і у синтезі секреторного матеріалу. Ширина клітин у базальній частині лежить в межах від 200 до 340 мкм, а товщина - близько 30 мкм [6]. Клiтини слинної залози вкритi ззовнi товстою, пружною базальною мембраною, яку добре помітно на електронних фотографіях (рис. 2.2). Під базальною мембраною знаходиться плазматична мембрана. Вздовж плазматичної мембрани розміщені мiтохондрiї перпедикулярно до неї. Цікаво, що зосереджені вони в основному на базальному полюсі секреторної клітини залози (рис. 2.2). Цитоплазма багата ендоплазматичним ретикулумом, який густо вкритий рибосомами.
Ядро i розвинутий апарат Гольджі повернуті у напрямку до внутрiшньої порожнини залози. Із комплексом Гольджі зв'язанi щільні гранули, які особливо добре виражені на внутрішній поверхні клітин, яка облямована багаточисельними ворсинками. Електронно-мікроскопічні фотографії дозволяють простежити формування щільних секреторних гранул в апараті Гольджі (рис. 2.3 Б) і їх рух у напрямку до апікальної частини клітини, на якій, власне, чітко видно ці ворсинки (рис. 2.3 А).
Секрет слинних залоз мотиля за багатьма властивостями подібний до фiброїну і, в основному, використовується для побудови хаток i ловчих сiток. Секрет також бере участь у травленні, оскільки містить травні ферменти. Серед них у секреті слинних залоз личинки комара-дергуна міститься трегалаза, гіалуронідаза, пептидаза, РНКаза, ДНКаза, естераза, активність яких відповідно становить 9,1, 7,5, 6,2, 1,2, 9,7 од/мг білка [152]. Крім цього, секрет містить до 3% мукопротеїнів [20]. Білки секрету можуть синтезуватись у секреторних клітинах залози або ж у клітинах інших тканин і транспортуватися до залози гемолімфою [7; 20].
З метою вивчення загальних принципів функціонування секреторних клітин, які є спільними для хребетних та безхребетних тварин, проводити дослідження на слинних залозах личинки Chironomus plumosus L. для вивчення функціонування Ca2+-транспортувальних систем у різних модельних експериментах є зручно насамперед з точки зору методичного підходу.
По-перше, виділення залоз не потребує ферментативної обробки, що пошкоджує секреторні клітини; по-друге, практично повна відсутність несекреторних клітин дозволяє використовувати цілу залозу; по-третє, завдяки великим розмірам залоз є унікальна можливість використовувати візуальний контроль при відносно невеликому збільшенні під світловим мікроскопом.
За допомогою мiнiатюрного скальпеля здійснювали препарування залоз пiд мiкроскопом МБС-1 шляхом декапiтацiї личинки, видалення вмiсту перших чотирьох сегментiв, перерізування слинної протоки i зв'язок у краплині зовнішнього розчину. Далі за допомогою очної піпетки залози переносили у пробірки для інкубації у розчинах певного складу відповідно до мети експериментів.
2.2. Розчини
Препарування залоз здійснювали у позаклітинному розчині, який також використовувався і для інкубації інтактних залоз та містив, ммоль/л: NaCl - 136,9, KCl - 5,36, CaCl2 - 1,76, Na2HPO4 - 0,35, KH2PO4 - 0,44, MgCl2 - 0,49, глюкоза - 5,55; рН 7,2. З метою пермеабілізації клітин використовували сапонін у концентрації 0,1 мг/мл, який додавали до цього розчину.
Інкубацію пермеабілізованих клітин проводили у розчині такого складу, ммоль/л: NaCl ? 15,3, KCl ? 129,94, Na2HPO4 ? 0,35, KH2PO4 ? 0,44, глюкоза ? 5,55; рН 7,0.
Для досягнення конкретних цілей ми використовували блокатори чи активатори різних Са2+-транспортувальних систем, які додавали до розчину інкубації залежно від поставленої мети у концентраціях наведених у табл. 2.1.
Усі розчини готували на бідистильованій воді при температурі +20 ?С, а їхнє рН перевіряли на стандартному рН-метрі перед кожним дослідом.
2.3