РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материал исследования
Изучена плазма крови 50 здоровых доноров (табл. 2.1) и 107 больных с узловыми поражениями щитовидной железы, среди которых у 70 пациентов был доброкачественный узловой зоб, а у 37 - рак щитовидной железы (табл. 2.2).
Таблица 2.1
Распределение доноров по полу и возрасту
Возраст
Пол18-35 лет36-55 летВсегомужчины161228женщины101222Всего262450
Так как доноры допускаются к сдаче крови после достаточно жесткого врачебного контроля, исключающего острые и хронические заболевания, мы квалифицировали ЛКС-гистограммы, полученные при исследовании образцов донорской плазмы, как показатели нормы. Предварительные исследования, выполненные в нашей лаборатории, [249, 251, 253, 260] не выявили существенных различий ЛКС-гистограмм доноров по полу и возрасту, что позволяет рассмат-ривать всю группу доноров как однородную.
Соотношение мужчин к женщинам у больных узовым зобом составило
1 : 4,3, а раком щитовидной железы - 1 : 16,5.
Таблица 2.2
Распределение больных с очаговыми поражениями щитовидной железы по возрасту и полу.
Возраст
(полных лет) Пол Всего мужчиныженщины менее 202221 - 3017831 - 402182041 - 503363951 - 603182161 - 70191071 и более167Всего1196107
2.2 Методы исследования.
2.2.1 Лазерная корреляционная спектроскопия.
ЛКС позволяет выполнять исследование системы гомеостаза в минимальных объемах сыворотки или плазмы. Поэтому кровь для анализа можно брать, как из вены, так и из мякоти пальца. Мы работали с венозной кровью. Одноразовой стерильной иглой пунктировали вену локтевого сгиба.
Вытекавшую самотеком кровь собирали в коническую пробирку. Очень важно не форсировать истечение крови массажем, так как это может привести к внутрисосудистому разрушению форменных элементов крови и грубому искажению результата анализа.
ЛКС дает информацию о состоянии системы гомеостаза по распределению в исследуемом субстрате частиц с различными гидродинамическими радиусами. Измерения можно проводить в сыворотке или плазме крови. Мы в качестве объекта исследования избрали плазму, так как при исследовании сыворотки информация о распределении частиц различного генеза оказывается неполной, в связи с тем, что в кровяной сверток уходит фибриноген. Для предотвращения свертывания крови и получения плазмы 1 мл крови собирается в пробирку с 4 мл стабилизирующего раствора "Глюгицир" (в состав которого входит натрия гидроцитрат и глюкоза). Размер частиц - компонентов "Глюгицира" меньше 1 нм, что ниже разрешающей способности лазерного корреляционного спектрометра. Прибор "не видит" компонентов "Глюгицира", и разведение не искажает результата.
Разведенная "Глюгициром" кровь центрифугируется при 3.000 об/мин на протяжении 15 мин. Отцентрифугированную плазму специальным дозатором разливают в сухие пробирки Эпппендорфа и сразу же замораживают в холодильнике при t0 = - 100C -150C. В замороженном виде материал можно хранить 3 месяца. Выполненные при освоении методики предварительные опыты показали, что результаты исследования материала после хранения в течение 90 суток не отличаются от результатов, полученных через 1-2 суток.
Транспортировка с места хранения в лабораторию осуществляется в бытовом термосе, в котором находятся упакованные в полиэтиленовые мешочки пробирки Эппендорфа и пересыпанный солью лед. Необходимо исключить даже кратковременное размораживание плазмы в период хранения или транспортировки. Особенно внимательно надо следить за стабильностью режима холодильника. Временные его отключения от питания с последующим включением могут привести к таянию замороженного образца и повторному замораживанию, что искажает и дискредитирует результат измерения.
Измерение выполняется с помощью лазерного корреляционного спектрометра, разработанного в отделе молекулярной и радиационной биофизики Санкт-Петербургского института ядерной физики РАН, изготовленного НПО "Прогресс" АН Украины (мощность лазера 8 мВт, длина волны излучения 0,633 мкм, диапазон размеров измеряемых частиц от 5 нм до 1·104 нм). Математическая обработка полученных результатов обеспечивается персональной ЭВМ (рис 2.1).
Непосредственно перед измерением образцы размораживаются в термостате при t0 = +370С в течение 30-40 мин. После оттаивания образцы центрифугируются при 6.000 об/мин в течение 15 мин для осаждения пылевых частиц, попавших в субстрат во время подготовительных процедур. 0,4 мл отцентрифугированного образца отсасывают с поверхности и помещают в кювету спектрометра. В кювете не должно быть пузырьков. Кювету закрывают крышкой во избежание попадания пыли или паразитного света.
Измерение проводится в соответствии с инструкцией и техническим паспортом прибора. Результаты измерений поступают в память ЭВМ, где хранятся в виде файла. Процедура измерения и обработки данных занимает от 7 до
10 мин.
Специально разработанная программа обеспечивает решение ЭВМ обратной спектральной задачи, что позволяет представить результат графически в виде гистограммы, на которой в логарифмическом масштабе изображается вклад в светорассеяние частиц с 32 различными гидродинамическими радиусами. Сопоставляя группу гистограмм, объединенных общими признаками (например, гистограммы больных узловым зобом), ЭВМ строит усредненную гистограмму, которая характеризует группу на основании n-го числа вариантов (рис.2.2).
Спектры, представленные 32 параметрами, трудно сопоставлять на основании визуальных оценок, находить в них сходство и различия. Разработанная на основе математической теории групп программа "Классификатор" позволяет провести многопараметровую обработку, после которой каждый спектр остаётся в памяти ЭВМ в виде единственной точки, проецированной на плоскость. При этом, на плоскостной распечатке выявляется "кучное" размещение на плоскости спектров, объединенных общими признаками, на