РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводилися упродовж 1991-2002 років у Державному науково-дослідному контрольному інституті ветпрепаратів та кормових добавок, господарствах та племпідприємствах Львівської області: Львівське облплемобєднання (ЛОПО), Дрогобицьке міжрайплемобєднання (ДМПО) та Судово-Вишнянське міжрайплемобєднання (СМПО).
Робота є складовою частиною тематичного плану ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. Тема роботи є фрагментом державної програми наукових досліджень у галузі ветеринарної медицини "Вивчити вплив на санітарно-біологічні показники сперми, фізіологічного стану бугаїв-плідників, технологічних прийомів роботи на державних племінних станціях України; встановити джерело мікробної контамінації сперми бугаїв-плідників і вивчити вплив мікробів на морфологію сперміїв. Розробити заходи підвищення санітарно-біологічних показників сперми та заплідненості корів і телиць", Державна реєстрація № 81100077 та "Розробити, вдосконалити і апробувати методи контролю біологічних препаратів", державна реєстрація №UA 01002790 Р та UA 01964003863.
Нами проведено лабораторні дослідження 1356 проб сперми, в т.ч. нативної - 765 проб; розбавленої до еквілібрації - 182; розбавленої після еквілібрації - 196, 213 проб відтаяної сперми від 96 бугаїв-плідників; 118 змивів з препуційної порожнини; 144 змиви з шкірного покриву; 156 проб секретів придаткових статевих залоз; 60 проб середовища для розбавлення сперми; 65 змивів з інструментів, посуду та рук обслуговуючого персоналу; 96 проб повітря до і після волого прибирання манежу і виробничих приміщень; 32 проби рідкого азоту, а також вміст матки від корів та телиць у різні терміни після отелення та з гострими запальними процесами.
Досліди проводили на великій рогатій худобі (телиці, корови та бугаї-плідники чорно-рябої породи при оптимальних на племпідприємствах та в господарствах умовах годівлі та утримання). У всіх господарствах відтворення стада організувалося на основі широкого застосування методу штучного осіменіння, з використанням замороженої сперми бугаїв в облицьованих і необлицьованих гранулах.
При постановці відповідних дослідів, тварин розподіляли в дослідні і контрольні групи з урахуванням принципу аналогів за віком, статтю, вгодованістю, клінічним статусом, продуктивністю та умовами утримання.
У процесі виконання роботи за загальноприйнятими методиками проводили клінічні (в т.ч. гінекологічні, мікробіологічні, бактеріологічні, мікологічні, електронно-мікроскопічні та біохімічні дослідження).
2.1 Методи відбору проб для мікробіологічних досліджень
У дослідах використовували дуплетні та триплетні еякуляти. Протягом експериментальних досліджень піддослідні тварини були клінічно здоровими. Бугаї-плідники щоденно були забезпечені моціоном в кільцевому коридорі.
Нативну сперму бугаїв-плідників отримували на вкорочену, асептично приготовлену, штучну вагіну з одноразовим спермоприймачем.
З дотриманням правил асептики переносили із спермоприймача проби сперми в стерильні пеніцилінові флакончики, які до дослідження ставили в термос з льодом та доставляли для дослідження не пізніше 3-х годин після відбору проб.
Проби сперми відбирали у такій послідовності: зі спермосховища переносили в стерильні пеніцилінові флакончики (необлицьовані гранули) або в тканинні мішечки (облицьовані гранули), поміщали в посудину Дьюара СД-5 та доставляли в лабораторію.
2.2 Методи визначення загальної мікробної забрудненості та колі-титру сперми бугаїв-плідників
Досліджувану сперму бугаїв-плідників розбавляли фізіологічним розчином у співвідношенні 1:10, а потім проводили послідовні розведення 1:100, 1:1000 і т.д., в залежності від очікуваного ступеня забруднення досліджуваних об`єктів. З кожного розведення, по 0,5 або 1 мл проби висівали в чашки Петрі з м`ясопептонним агаром, інкубували при 37,5оС протягом 48 годин. Кількість мікробних тіл в 1 мл сперми обчислювали за формулою:
К= Н х Д
В х С
К - кількість мікробних клітин в 1 мл сперми;
Н - кількість підрахованих колоній;
Д - ступінь розведення проби;
В - об`єм матеріалу, взятого для посіву;
С - площа чашки, на якій проведений підрахунок колоній.
Фізіологічний розчин, середовище для розбавлення та лабораторний посуд перевіряли на стерильність перед проведенням досліджень.
Відбір проб та мікробіологічні дослідження проводились згідно з ГОСТ 209092-1-75 та ГОСТ 20909-2-75 "Сперма быков неразбавленная. Методы микробиологических исследований". Заморожену сперму бугаїв досліджували за методикою племпідприємств [1983]. На даний час нами розроблено "Методику мікробіологічного дослідження сперми бугаїв-плідників, яка застосовується при штучному осіменінні" [2002].
Подальші дослідження сперми проводили згідно з вимогами, закладеними в ГОСТ 20909-2 "Сперма быков неразбавленная. Методы микробиологических исследований".
Для виділення синьогнійної палички, з досліджуваного матеріалу проводили посіви на МПБ з глюкозою, МПА, напіврідкий агар за Триленком, середовище Сімонса та ДУКС-5.
Посіви інкубували при температурі 37,5оС протягом 7-10 діб. Ріст культур перевіряли щодня. Виділення та ідентифікацію культур синьогнійної палички із сперми та змивів геніталій від тварин проводили згідно з методичними рекомендаціями, розробленими ВІЕВ В.А.Зуділіним (1982).
При культивуванні анаеробів, сперму бугаїв-плідників висівали у дві пробірки з середовищем Кітт-Тароцці. Посіви витримували в термостаті при 37оС протягом 10 діб. Через кожні 3-4 дні готували мазки, фарбували їх за Грамом та ідентифікували наявну мікрофлору.
2.3 Методика визначення мікробної забрудненості змивів препуційної порожнини, секретів додаткових статевих залоз, шкірного покриву, інструментів та обладнання
Змиви з препуційної порожнини бугаїв отримували після туалету зовнішньої поверхні статевих органів, введенням 10 мл стерильного фізіологічного