РОЗДІЛ II МАТЕРІАЛ І МЕТОДИКИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Об'єкти дослідження
У даному розділі приводиться опис методів, приладів і реактивів, що використовувались нами при виконанні експери-ментальної частини.
Об'єктами вивчення були різні види родів Thymus L. (ч. повзучий, ч. Маршаллів), Origanum L. (м. звичайна, м. біла), Majorana Mill.(м. садовий), заготовлені в умовах України у період 1999-2002 р., а також сировина з цих рослин.
Для ідентифікації і кількісного аналізу біологічно-активних речовин використовували методи тонкошарової хроматографії на папері, тонкошарових пластинах "Silufol UF-254" і в незакріпленому шарі сорбенту, хімічні методи аналізу, УФ-, ІЧ- і ПМР- спектроскопію, газорідинну і високоефективну рідинну хроматографію.
Виділення індивідуальних сполук проводилося на колонках, заповнених сорбентом (поліамід, силікагель і інш.), методом єлюювання. Використовувалися стандартні зразки: реактиви, розчинники, які відповідали вимогам ДФ XI і Державній фармакопеї України.
Для хроматографування готувалися системи із застосуванням розчинників кваліфікації н-бутанол (ч.д.а.), кислота оцтова (х.ч.), бензол (ч.д.а.), етилацетат (ч.д.а.), кислота мурашина (х.ч.), хлороформ (х.ч.), метанол (ч.д, а.), кислота хлористоводнева (х.ч.), формамід (х.ч.), вода дистильована (ч.д.а.), ацетон (ч.д.а.), піридин (х.ч.), етанол (ч.д.а.), хлористий метилен ( х.ч.), діоксан (х.ч.), циклогексан (х.ч.) [ 30, 31, 117].
Співвідношення розчинників в системах для хроматографіїх дано в об'ємних одиницях:
№ 1 н-бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:5) - для виявлення флавоноїдів, кумаринів, ароматичних і амінокислот, азотистих основ, дубильних речовин, антраценпохідних;
№ 2 15% розчин оцтової кислоти - для виявлення флавоноїдів і поліфенольних сполук;
№ 3 петролейний ефір - ацетонітрил - абсолютний етанол (10:10:80) - для виявлення каротиноїдів;
№ 4 петролейний ефір - бензол - абсолютний етанол - ідентична N 3;
№ 5 бензол - етилацетат - оцтова кислота - формамід (70:30:2:1) - для виявлення флавоноїдів, фенолкарбонових кислот, продуктів їх деструкції;
№ 6 хлороформ - етанол (7:3) - для виявлення фенологлікозидів, продуктів їх деструкції;
№ 7 5% оцтова кислота - для виявлення фенолкарбонових кислот;
№ 8 хлороформ - етанол - оцтова кислота - вода (6:2:0,1:0,1) - ідентична N 7;
№ 9 30% оцтова кислота - ідентична N 2;
№ 10 етилацетат - бензол (1:2) - для виявлення кумаринів;
№ 11 гексан - бензол - метанол (5:4:1) - ідентична N 10;
№ 12 хлороформ - формамід (1:1) - ідентична N 10;
№ 13 н - бутанол - оцтова кислота - вода (10:2:3) - для виявлення оксикоричних кислот;
№ 14 н - бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2) - для виявлення оксикоричних кислот, амінокислот;
№ 15 н - бутанол - оцтова кислота - вода (40:12:28) для виявлення катехінів;
№ 16 н - бутанол - піридин - вода (6:4:3) - для виявлення вуглеводів;
№ 17 етилацетат - мурашина кислота - оцтова кислота - вода (18:3:1:1)- для виявлення вуглеводів;
№ 18 н - бутанол - оцтова кислота - вода (7:2:2) - для виявлення амінокислот;
№ 19 бензол - етанол - оцтова кислота (45:3:2) - для виявлення фенолів в ефірних маслах;
№ 20 петролейний ефір - ацетонітрил - абсолютний етанол (10:10:80) - ідентична N 6;
№ 21 хлороформ - метанол (9:1) - для виявлення фенолкарбонових кислот;
№ 22 етанол - 25% розчин аміаку (9:1) - для виявлення азотистих основ;
№ 23 петролейний ефір - толуол - метанол - вода (8:2:8:2) - для виявлення сесквітерпенових лактонів і антраценпохідних;
№ 24 етилацетат - оцтова кислота - вода (10:2:3) - ідентична N 1;
№ 25 етилацетат - оцтова кислота - (50:20) - ідентична №2;
Попередню інформацію про наявність флавоноїдів в досліджуваних об'єктах, отримували по результатах якісних реакцій, які дозволяли віднести сполуки, до певного класу (ціанідинова реакція і її модифікація по Бріанту), реакції з лугами і солями важких металів (хлориди алюмінію, цирконію, сурьми, заліза), з борно-лимонним реактивом [ 30, 31, 103, 114, 181 ].
Ціанідинова реакція по Бріанту
До 1 мл концентрованої метанольної витяжки з рослинної сировини (1:5) (або 5 мг речовини) додавали 2 мл 50% метанолу, декілька мг магнієвих стружок і 3-4 краплі концентрованої хлористоводневої кислоти. Суміш збовтували, додавали 1 мл октанолу і спостерігали забарвлення верхньої і нижньої фаз. Реакція дозволяла виявити і ідентифікувати глікозиди (забарвлення нижньої фази) і аглікони (забарвлення верхньої фази) флавоноїдів.
З хлоридом окисного заліза [ 30, 31 ]. Появу зеленого забарвлення використали для виявлення 5 - оксигруп в молекулі флавоноїдів.
З метанольним розчином калію гідроксиду [ 30, 31 ] спостерігали виникнення жовтого, оранжевого або оранжево-червоного забарвлення.
Реакція Барджелліні
До 1 мл концентрованої етанольної витяжки з рослинної сировини (1:5) (або до розчину 5 мг речовини) додавали розчин натрію етилату. Поява синьо-зеленого забарвлення і осадку вказували на наявність в молекулі флавоноїду трьох гідроксильних груп.
Госипетінова реакція
До спиртового розчину 2-3 мг речовини додавали 0,01 г п-бензохіноліну. У разі наявності 5,8-діоксифлавонолів спостерігали червоно-коричневе забарвлення і осадок [ 30, 31 ].
Флавоноїди характеризуються значною інтенсивністю поглинання світла в УФ - області, виявляючи характерні максимуми, що відносяться до першої і другої смуг [ 13, 26, 155, 182 ]. Для вивчення спектрів поглинання використовувалися прилади, що дозволяють реєструвати оптичну густину розчинів в УФ- і видимій областях: СФ-26, "Specord UV-vis", спектрометр Beckman - 5240, фотоелектроколориметр КФК-3 МП.
Для виділення і ідентифікації флавоноїдів використовували метод
- Київ+380960830922