Зміни рибницько-біологічних показників при аеромонозі та весняній віремії коропів

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили на цьоголітках, однорічках і дволітках коропа, які
найбільш уразливі до аеромонозу і весняної віремії [4, 5, 42, 65]. В роботі
застосовували рибницько-біологічні, мікробіологічні, іму­нологічні та
гематологічні методи досліджень за прийнятими в рибництві і іхтіопатології
схемами [36, 60, 92].
Всього за період 1986-2003 рр. було обстежено 2047 ць­огорічок і дволіток
коропа. З них для визначення імуно­логічних і гематологічних показників
відібрані проби від 591 риби, відпрацьована доза патогенів на 210 коропах,
поставлені біопроби на 800 рибах, вакциновано 450 коропів.
У піддослідних риб визначали довжину, масу, коефіцієнт вгодованості за
Фультоном [33, 92], щільність посадки, вихід, приріст та рибопродуктивність.
Серії дослідів по вакцинації проводили в двократній повторності у садках
корисним об’ємом 4 м3, площею 4 м2 при щільності посадки коропа 170 екз./м3,
використовуючи посадковий матеріал зі ставків. Однорічок спочатку годували
пастоподібною сумішшю з відсівок комбікорму 111-9 зі вмістом протеїну 30,5-34,7
%, для вирощування дволіток коропа застосовували суміш: комбікорм 111-9 у
кількості 45,5 %, фарш боєнських відходів — 50%, фосфатиди—1%, риб'ячий жир—1%,
премікс ВРП-111-2 укр.—1%, метіонін кормовий—1,5%. Добовий раціон риби складав
5,8 - 15,5% від маси риби при частоті годівлі 8-12 разів протягом дня. Добовий
раціон визначали з урахуванням температури води і маси риби. Годували риб з
масою понад 200 г — 12-14 разів протягом світлового дня. Добовий раціон риб у
контролі складав 3,6—6,7% від їхньої маси, що приймали за середній рівень
годівлі.
Як антиген для вакцинації використовували штам віру­лентної культури A.
hydrophіla 3605. Для напрацювання бакте­рійної маси культуру інкубували на
рибо-пептоновому агарі (РПА) при температурі 26оС 24 години; а після цього
зми­вали стерильним фізіологічним розчином до отримання густої суспензії.
Бактерії інактивували прогріванням при темпера­турі 70оС протягом 30 хвилин.
Після цього до бактеріальної маси додавали колоїдний гідроокис алюмінію у
співвідношенні 1: 1 і перевіряли на стерильність шляхом висіву на РПБ та РПА.
Вакцинацію дволіток коропа здійснювали двома способами згідно прийнятих в
імунології схем [61, 124]: шляхом введення антигену в черевну порожнину і
шляхом гіпе­росмотичної інфільтрації через зябра і покрив тіла. Досліди
проводили в трьох садках Київського виробничого тепловодного рибницького
господарства (КВТРГ). В кожний садок висаджували по 150 екз. коропа середньою
масою 100 г. В черевну порожнину вводили по 0,5 мл бактерину. Доза мікробної
суспензії складала 1 млрд. клітин. Гіперосмотичну інфільтрацію здійснювали за
допомогою сольового розчину. Коропів розміщували у 5% розчин хлориду натрію і
витримували протягом 2 хвилин, після цього витримували 2 хвилини в роз­чині
антигену концентрацією 40 млн. кл./мл. Після цього риб відсаджували у садок з
прісною водою. Контрольній групі риб вводили в черевну порожнину стерильний
фізіологічний розчин. Рибу годували комбікормом згідно рибницьких норм.
Температура води в садках коливалась від 14,8о до 26,1оС, вміст розчи­неного у
воді кисню від 3,8 до 8,0 мгО2/л. Вакцинацію коропів проводили трикратно - на
першу, десяту, і сорок шосту добу. Перед кож­ною вакцинацією відбирали кров для
визначення бактерицидної активності сироватки крові. Через 20 днів після
останньої вакцинації коропів було заражено вірулентною культурою A. hydrophіla
3605.
Для мікробіологічних досліджень відбирали по 3-5 риб з кожної дослідної групи,
стерилізували інструмент і поверхню риби полум’ям, після чого розтинали черевну
по­рожнину. Відбирали внутрішньочеревну рідину, фрагменти печінки, селезінки,
нирок і висівали на живильний агар або рибо-пептоновий бульйон (РПБ). Чисті
культури бактерій виділяли на твердих поживних середовищах. Ідентифікування
бактерій проводили на дифе­ренціально-діагностичних середовищах згідно
прийнятих в іхтіопатології методів [92]. В роботі ви­користовували вірулентний
штам бактерії Aeromonas hydrophіla №3605, який було виділено від хворих на
гострий перебіг аеромонозу коропів. Зараження усіх дослідних груп риб
здійснювали шляхом введення в черевну порожнину добової мікробної культури A.
hydrophіla в дозі 0,5 мл/рибу (3,7-7,5 млрд. кл./кг живої ваги риби) і вірусу
Rhabdovіrus carpіo штам 120 б в дозі 0,5 мл/рибу (6,5 lg ТЦД 50/мл). Результати
біопроб враховували за виявленням характер­них клінічних ознак захворювання і
загибелі коропа, а також по виділенню початкової культури патогену від ураженої
риби. Матеріал обробляли за методом Ріда і Менча [92]. Зараження проводили у
дозах, що викликали загибель 50% дослідних риб (LD50). Перед початком кожної
біопроби проводили відпрацювання дози патогену на 25-30 рибах з тієї ж
дослідної групи.
При імунологічних дослідженнях визначали відносний і абсолютний вміст Т- і
В-лімфоцитів в периферійній крові за до­помогою реакції розеткоутворення з
індикаторними еритроцита­ми барана [60].
Виявлення Т- і В-лімфоцитів. Для виявлення Т-лімфоцитів у риб використовували
3-5 добові еритроцити барана. Індикаторні еритроцити для В-клітин готували за
методикою описаною Н.Н.Кулінічем і О.Е.Галатюком [60], причому в нашій
модифікації були використані глютаризовані, танізовані еритроцити барана [93,
94], які обробляли гемолізином і комплементом. При визначенні Т-лімфоцитів
враховували тільки активні клітини, які встигали прореагувати з еритроцитами
барана за 15 хвилин без наступ­ного витримування на холоді. Розетки з
лімфоцитами фіксували розчином глютарового альдегіду і ф