РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт дослідження
Дослідження за допомогою світлової мікроскопії. Відповідно до мети та завдань
дослідження експеримент було проведено на 160-ти 5-тижневих японських перепелах
(Coturnix coturnix japonica). Дослід проводився на птахах такої вікової групи
тому, що саме на п’ятому тижні відбуваються останні етапи статевого дозрівання.
Птахи цього віку характеризуються чутливістю до факторів, які стимулюють чи
пригнічують репродуктивну систему, що сприяє кращому вивченню фізіологічних
механізмів статевого дозрівання.
В досліді використовували тільки самців, щоб виключити вплив статевих циклів,
властивих самицям, на регуляторну взаємодію досліджуваних залоз. Птахів
утримували в умовах одного віварію на стандартному раціоні. Світловий режим: 14
годин – світло (з 7 до 21 години), 10 годин – темрява (з 21 до 7 години).
У ході експерименту було створено 28 піддослідних груп, в кожній з яких було по
4-6 птахів. Птахам одноразово вводили в той або інший час доби мелатонін
(вранці – о 7оо, вдень – о 13оо, ввечері – о 19оо або вночі – о 1оо) після того
чи іншого препарату. В кожен з чотирьох періодів доби птахи були поділені на 7
груп залежно від препарату, який вводився:
Фізіологічний розчин (доза – 30 мкг/100 г маси тіла) (контроль).
Мелатонін (доза – 10 мкг/100 г маси тіла).
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид (блокатор D1 дофамінових рецепторів (доза – 0,8
мкг/100 г маси тіла)).
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид, а через 1 годину мелатонін (в тих самих дозах),
Галоперидол (блокатор D2 дофамінових рецепторів (доза – 30 мкг/ 100 г маси
тіла)).
Галоперидол, а через 1 годину мелатонін (в тих самих дозах).
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид, потім галоперидол, а через 1 годину мелатонін (в
тих самих дозах).
Мелатонін вводився перорально. Галоперидол вводили внутрішньо-м’язово, тоді як
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид вводили в порожнину третього шлуночка мозку
(методика введення речовин буде пояснена нижче). Тому для чистоти досліду
птахам 1, 2, 3 і 4 груп внутрішньом’язово вводили фізіологічний розчин (в дозі
30 мкг/100 г маси тіла), а також птахам 1, 2, 5 і 6 груп фізіологічний розчин
вводили в порожнину третього шлуночка мозку (в дозі 0,002 мл/ на птаха).
Через 2 години після введення мелатоніну птахів декапітували.
Ультраструктурне дослідження. Для ультраструктурних досліджень додатково був
проведений дослід на 24 самцях 5-тижневих японських перепелів (Coturnix
coturnix japonica), яких утримували за аналогічних умов, що були описані вище.
В ході експерименту було створено 8 піддослідних груп, в кожній з яких було по
3 тварини. Птахам одноразово вводили вдень – о 13оо або ввечері – о 19оо
мелатонін після того чи іншого препарату. В кожен з двох періодів доби птахи
були поділені на 4 групи залежно від препарату, який вводився:
Фізіологічний розчин (контрольна група).
Мелатонін (доза – 10 мкг/100 г маси тіла).
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид (блокатор D1 дофамінових рецепторів (доза – 0,8
мкг/100 г маси тіла)).
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид, а через 1 годину мелатонін (в тих самих дозах).
Умови введення препаратів повністю відповідають таким у першій частині досліду.
2.2. Характеристика використаних у досліді препаратів
Мелатонін – N-ацетил-5-метокситриптамін, похідний серотоніну, основний гормон
епіфіза. Вводили у дозі 10 мкг на 100 г маси тіла.
Галоперидол (галофен, сенорм) –
4-[4-(пара-хлорфеніл)-4-оксипиперидіно]-4-фторбутирофенон, центральний блокатор
дофамінових D2-рецепторів; конкурентний інгібітор дофаміну [286]. Вводили у
дозі 30 мкг/100 г маси тіла.
R(+)-SCH-23390 гідрохлорид –
R(+)-7-chloro-8-hydroxy-3-methyl-1-phenyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3-benzazepine
hydrochloride (фірми Sigma) – селективний антагоніст D1 дофамінових рецепторів.
Вводили у дозі 0,8 мкг/100 г маси тіла. Цей препарат не використовується в
фармакології, на відміну від попередніх двох, проте є найпоширенішим блокатором
D1-рецепторів, який використовується в сучасних експериментальних дослідженнях
[84, 98, 161, 217, 272].
2.3. Гістологічні та морфометричні методики
Дослідження за допомогою світлової мікроскопії. Після декапітації птахів
гіпоталамічну область мозку, аденогіпофіз, епіфіз та гонади фіксували для
подальшої гістологічної обробки. Фіксація матеріалу здійснювалась у рідині
Буена (гіпоталамічна область мозку, епіфіз та сім’яники), та в 10%-ному
формаліні (аденогіпофіз). Після чого його заливали за стандартною методикою в
парафін і виготовляли на санному мікротомі фронтальні серійні зрізи
гіпоталамічної області мозку та зрізи сім’яників завтовшки 5 – 6 мкм, а
аденогіпофіза та епіфіза – завтовшки 3 – 4 мкм.
Зрізи гіпоталамуса фарбували крезиловим фіолетовим за Нісслем. Активність
нейроцитів дрібноклітинних ядер визначали за величиною клітинних ядер,
кількістю та розмірами гранул нейросекрету у цитоплазмі. Зрізи аденогіпофіза
фарбували альціановим синім, реактивом Шиффа та оранжем “G” за Herlant [108].
На рівні аденогіпофіза робота була сконцентрована на визначенні активності
гонадотропоцитів. Особлива увага приділена саме даним клітинам, оскільки
гонадотропоцити є важливою ланкою, через яку регуляторні впливи з гіпоталамуса,
епіфіза та моноамінергічних систем мозку передаються на статеві залози. Зрізи
сім’яників та епіфіза фарбували гематоксиліном Бемера та еозином.
Висновки про зміну активності пінеалоцитів епіфіза робили на підставі аналізу
морфометричних характеристик цих клітин, зокрема розміру ядра, прозорості та
складу цитоплазми.
Гістологічні препарати аналізували на світлооптичному мікроскопі за допомогою
окуляр-мікрометра МОВ-1-15х, та пакета програм
- Київ+380960830922