Розділ 2
Власні дослідження
2.1. Вибір напрямів досліджень. Матеріали і методи досліджень
Дисертаційна робота виконана впродовж 1996–2004 років у лабораторії
фармакологічних досліджень Державного науково-дослідного контрольного інституту
ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики
України, а також на кафедрі хірургії Львівської національної академії
ветеринарної медицини імені С. З. Гжицького.
Для вивчення фізіолого-морфологічної дії натрієвмісних препаратів на
мікроорганізми, культуру клітин, личинки дрозофіли; слизові оболонки, шкіру,
інфіковані та неінфіковані рани лабораторних та домашніх тварин проведено 11
основних дослідів. Загальна схема проведення експериментальних досліджень
подана на рисунку 2.1.
Складниками всіх досліджуваних новостворених натрієвмісних сполук (1 та 2%
гліцетинат, 1,6 та 2% калінат та аетинат) є йон натрію, гліцерин, етиловий
спирт. До складу аетинату, окрім вищевказаних інгредієнтів, уведений діетиловий
ефір, до препаратів 1,6 та 2% калінат уведений калій. У нашому випадку
використано властивість абсолютного спирту легко реагувати з металічним натрієм
і утворювати алкоголяти [170].
Вивчення інтенсивності споживання кисню культурою клітин та участь окремих
ланок метаболізму в генерації АТФ в залежності від концентрації 1% гліцетинату
здійснювали полярографічним методом, відновлювальну її активність - за
допомогою потенціометра. Протимікробну дію натрієвмісних препаратів визначали,
використовуючи штами мікроорганізмів Ps. aureginose, St. epidermis, St. aureus,
E. coli, Pr. vulgaris, Кlebsiella.. Встановлювали дозозалежну загибель личинок
мухи Drosofila melanogaster від препаратів 1 та 2% гліцетинат і їх складників з
метою використання личинок для токсикологічного контролю засобів захисту
тварин. На білих щурах і кролях, вивчали місцевоподразнюючу та
шкірно-резорбційну дію 2 і 1% гліцетинату в гострому та хронічному дослідах, а
також дію
препаратів на слизову оболонку ока. Препарат оцінювали за реакцією слизової
оболонки ока, шкіри та за гематологічними показниками. Вивчали
фізіолого-морфологічну характеристику можливих впливів натрієвмісних препаратів
на організм білих щурів за умов експериментального набряку, викликаного
формаліном.
Протизапальну дію препарату на білих щурів за умов моделювання запального
процесу визначали шляхом введення 50% олійного розчину скипидару. Встановлювали
ранозагойнуактивність 1% гліцетинату шляхом визначення швидкості епітелізації
інфікованої рани в кролів. Використовували 1 та 2% гліцетинат в хірургічній
практиці та за лікування довгонезагойних і поганогранулюючих ранах кінцівок у
великої рогатої худоби, коней, собак і гнійно-некротичних процесах у собак.
Оцінка дії натрієвмісних препаратів на клітинному рівні.
Дослідження дії натрієвмісних препаратів на культуру клітин. В досліді
використовували культуру клітин курячого зародку 7-10-денного віку. Для
вилучення зародку із яйця проводили наступні маніпуляції: шкаралупу над
повітряним простором дезінфікували та ножицями зрізували по краю прикріплення
хоріон-алантоїсною оболонки, анатомічним пінцетом розривали хоріон-алантоїс,
захоплювали і піднімали зародок, відсікали пупковий канатик, голову та
кінцівки, а тіло вміщували у чашку Петрі та подрібнювали ножицями до розміру
2-4 мм. Кусочки пўятикратно відмивали від крові сольовим розчином Хенкса і
трипсинізували 0,25% розчином трипсину впродовж 18 год за to +4 оС [88]. Згодом
клітини центрифугували 5 хв за 800-1000 об/хв і супернатант фільтрували через
шар стерильної марлі. Стерильність контролювали шляхом посіву 0,1 мл суспензії
клітин у пробірки з мўясо-пептонним бульйоном з глюкозою.
Для вирощування культури клітин експериментально підбирали певні посівні дози.
Для цього, в кожному випадку, після трипсинізації, проводили підрахунок клітин
в одиниці об’єму поживного середовища за допомогою камери Горяєва, фарбуючи
клітини 0,1% розчином кристалічного фіолетового на 0,1 М розчині лимонної
кислоти. Встановлену кількість клітин розводили поживним середовищем з
розрахунку 2Ч105-3Ч105 клітин/мл. Суміш розливали у пробірки і на матраци,
щільно закривали гумовими корками та інкубували у термостаті за температури
370С. Оцінку характеру росту культури клітин проводили щоденно під мікроскопом
за збільшення 7х8.
Препарат вносили в посудину з суспендованими клітинами у розрахунку 0,005, 0,01
та 0,02 мл на 1 мл суміші та інкубували у термостаті за температури 37 0С. На
3-тю добу визначали характер росту культури і виражали у хрестах: +++ -
інтенсивний ріст, ++ - середній ріст, + - незначний ріст. Також констатували
зміну рН середовища культивування.
Інтенсивність споживання кисню культурою клітин (нг-атом О/мл культури за 1 хв)
визначали полярографічним методом, який ґрунтується на вимірюванні сили струму,
що виникає під час окиснювально-відновних процесів, які відбуваються на
поверхні робочого електрода. Для полярографічного методу характерна висока
чутливість: за його допомогою вимірюють 10-4—10-7 М концентрації. Це один з
найточніших фізико-хімічних методів вивчення фізіологічних та біохімічних
процесів на молекулярному рівні [13]. Одночасно визначали відновлювальну
активність клітин шляхом потенціометричного вимірювання перетворень фериціаніду
калію (K3 [Fe(CN6)] у фероціанід (K4 [Fe(CN6)]. Для того в комірку з клітинами
вносили 10-4 М фериціаніду калію. Дані подано в мкг перетвореного фериціаніду
калію в 0,1 мл культури клітин за хвилину ( мкг K3 [Fe(CN6)] / 0,1 мл за 1 хв;
К3 …./0,1 мл за 1хв).
Дослідження проводили в термост