РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота складається з експериментальної та клінічної частини.
В експериментальній частині вивчався стан гемомікроциркуляторного русла головного мозку у тварин з тяжкою черепно-мозковою травмою.
2.1. Експериментальна частина.
Експериментальне дослідження проведене нами на 20 щурах лінії Вістар, всі половозрілі самці вагою 150 - 210 г. Всім тваринам проведено моделювання тяжкої черепно-мозкової травми вільнопадаючою вагою за методикою П.Ф.Кришеня, [47] у власній модіфікації. Пристрій для моделювання тяжкої черепно-мозкової травми представляє собою дві роз'ємні частини: перша - для фіксації досліджуваної тварини, друга ? для нанесення тяжкої черепно-мозкової травми. Фіксуюча частина пристрою являє прозору пластину, виконану з плексигласу, з вкрученими металевими стрижнями на периферії. Ударна частина має П-образний металевий опір до 50 см заввишки. До середини її поперечника на щільному нерозтяжному джгуті прикріплений металевий вантаж масою 50 г, з можливістю прицільного опускання по серединному стрижню на фіксовану голову тварини у означеній проекції. Стрижні фіксуючої частини конструкції дозволяють за допомогою еластичних джгутів фіксувати кінцівки досліджуваної тварини в положенні лежачи на череві. За цих умов забезпечується додаткова фіксація голови тварини (навколо тім'яно-потиличної області) до пластини м'яко-еластичним джгутом і виключення зайвих рухів її тіла та голови, чим досягається точне влучення у тім'яно-лобову область при моделюванні тяжкої черепно-мозкової травми.
Тварини були розподілені на 4 групи в залежності від введених препаратів: в 1 досліджуваній групі вводилося 2 мл фізіологічного розчину, в II - L-лізину есцинат в дозі 1 мл водного розчину на 100 г ваги, в III - перфторан з розрахунку 5 мл/кг маси тіла. В IV групі сумісно використовували перфторан та L-лізину есцинат в вище вказаних дозах. Введення препаратів проводилось в хвостову вену щурів, через 3 години після нанесення тяжкої черепно-мозкової травми на фоні розвитку набряку головного мозку. Забій тварин шляхом декапітації з препаруванням мозкової тканини проводився через 4 години після введення препаратів, тобто через 7 годин експерименту [48, 68, 84]. Всі досліди проводилися згідно вимогам комісії з експериментальних тварин при Науковій медичній раді МОЗ України.
Морфологічне дослідження мозку експериментальних тварин, у тому числі стану ГМЦР у складі мозкової кори, проводили диференційовано у 3 різних ділянках поверхневих областей лобної частки мозкової кори: 1) у зоні первинного ушкодження, що відповідає безпосередньому механічному удару; 2) у перифокальній ділянці, розташованій на відстані до 2 мм навколо зони удару; 3) віддалених від зони удару ділянках, а саме на передньому полюсі лобної частки.
Для приготування напівтонких зрізів ділянки мозкової тканини об'ємом близько 1 мм3 фіксували в 2,5%-му розчині глютаральдегіда на 0,1 М фосфатному буфері (pH 7,4) протягом 2 годин при 20?-22?С. Дофіксацію проводили 1%-вим розчином 4-окису осмію на тому ж буфері протягом 2 годин. Після зневоднювання зразки тканини укладали в суміш епона і аралдіта відповідно до рекомендацій Weekly [92]. Напівтонкі зрізи завтовшки 1 мкм приготовляли на ультрамікротомі УМТП-5-М. Для візуалізації структур та проведення морфометричних вимірів зрізи забарвлювали метиленовим синім - азуром II - основним фуксином відповідно до рекомендацій Humphrey з співробітниками [148].
При проведенні морфометричного дослідження керувалися загальними принципами, викладеними Г.Г.Автанділовим [1, 2], проводили кількісну оцінку таких показників:
- питомого об'єму ділянок периваскулярного набряку;
- питомого об'єму ділянок перицелюлярного набряку;
- відносної кількості мікросудин ГМЦР у стані оклюзії;
- відносної кількості нейроцитів з дистрофічними змінами;
- кількісної щільності нейроцитів;
- кількісної щільності макрогліоцитів.
Питомі об'єми ділянок периваскулярного і перицелюлярного набряку визначали методом крапкового рахунку [1, 2] при використанні окулярних вставок за формулою:
,
де Vv - питомий об'єм структури;
Pi - кількість крапок перетину ліній тест-системи, які доводяться на структуру;
Pt - загальна кількість крапок перетину ліній тест-системи.
Для розрахунку кількісної щільності клітин нервової тканини використовували формулу De Hoff, Rhines [145] для випадково розподілених структур:
NV = NA / D,
де NA - кількість профілей клітин в одиниці площі зрізу;
D - середній тангенціальний діаметр клітин.
Біометрична обробка кількісних даних проводилась у відповідності до рекомендацій Г.Ф.Лакіна [51]. Одним з самостійних елементів біометрії є статистичне планування експеримента. Для визначення необхідного об'єму вибірки завчасно визначали наближене значення середньої арифметичної і середнього квадратичного відхилення [75]:
;
,
де x - середня арифметична;
xmin і xmax - ліміти значень параметра;
sx - середнє квадратичне відхилення;
K - коефіцієнт, що встановлюється в залежності від об'єма вибірки.
Визначення необхідного об'єму вибірки встановлювали за формулою:
,
де n - чисельність вибірки;
t - нормоване відхилення, з яким пов'язаний той чи інший рівень значущості;
sx - вибіркова дисперсія;
? - величина, що визначає межі довірчого інтервала.
Подальша біометрична обробка включала визначення таких характеристик, як: х - середня арифметична; sx2- дисперсія; sx - середнє квадратичне відхилення; Cv - коефіцієнт варіації; ss - помилка середнього квадратичного відхилення. Для обчислення означених характеристик використовували стандартні формули [51]:
;
;
;
;
,
де n - об'єм вибірки;
xi - варіанти вибірки.
При визначенні достовірності відмінностей між вибірками враховували критерій t Стьюдента, що обчислювався за формулою:
,
де x1 та x2 - середні арифметичні вибірок, що порівнюються;
ss1 та