РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ Й МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Біологічний матеріал для проведення досліджень
Із попереднього скринінгу колекції 90 сортів різного еколого-географічного походження і 26 мутантних ліній ярого ячменю [143], були відібрані сорти, контрастні за рівнем асоціативної азотфіксації при інокуляції ризоентерином, який рекомендовано для застосування під ячмінь [126]. Сорти вітчизняної селекції: Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14. Сорти закордонної селекції: Lina (Швеція), Geran (Чехія), Albert (Чехія), Piramid (Франція) і мутантна лінія Еректоїд 2-21, отримана методом хімічного мутагенезу на кафедрі селекції, генетики та насінництва Харківського національного аграрного університету ім.В.В.Докучаєва.
Чиста культура бактерій E. aerogenes 30Ф [193] була одержана з лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології УААН. Культура зберігалась на середовищі наступного складу: гороховий відвар (100г гороху на 1л води) 100мл/л; сахароза 10г/л; глюкоза 10г/л; агар 20 г/л. Бактерії E. aerogenes 30Ф є складовою біопрепарату ризоентерину для підвищення продуктивності ячменю.
2.2. Обсяг виконаних робіт
В ході досліджень з індукції калюсних культур для 9-ти відібраних сортозразків ячменю в 2002р. було висаджено 868 незрілих зародків, які виділені з колосків 277 рослин, в 2003р. - 216 незрілих зародків з колосків 61 рослини, в 2004р. - 103 незрілих зародка з колосків 43 рослин ячменю. Таким чином, висновки по даній роботі зроблені на підставі трирічних польових і лабораторних досліджень калюсного матеріалу, отриманого з 1187 незрілих зародків від 381 батьківської рослини.
Для досліджень впливу екзометаболітів калюсних ліній на розвиток бактерій в процесі субкультивування було створено 311 клітинних ліній. Із них відібрано 49 клітинних ліній сортів Харківський 74, Одеський 100, Одеський 131, Донецький 14, Geran, Lina і Еректоїд 2-21. В зв'язку з труднощами при введенні в культуру та отриманні клітинних ліній у сортів Albert і Piramid аналіз впливу екзометаболітів калюсних тканин на ріст бактерій не зроблений для цих сортів.
Від кожного сорту ячменю в 5-ти кратному біологічному повторенні було проаналізовано ріст бактеріальної культури на середовищах з екзометаболітами 7-ми калюсних ліній різних генотипів рослин, в 3-разовому повторенні проводилось визначення кількості бактерій для кожного генотипу клітинної лінії. Проведено 15-21 підрахунків концентрації бактеріальних клітин в розрахунку на один сорт ячменю. Повторність контролю 3-разова. Експерименти з інокулюванням бактеріями середовищ з екзометаболітами проростків і калюсних тканин проводились одночасно. Для інокулювання використовували одну бактеріальну суспензію для всіх варіантів повторення.
2.3. Методи досліджень
Методика наших досліджень складається із поєднання класичних польових методів селекції та традиційних лабораторних методів біотехнології та мікробіології.
Основні етапи досліджень представлені на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Загальна схема досліджень
2.3.1. Отримання калюсних ліній ячменю. Введення сортів ярого ячменю в культуру проводилось на модифікованому середовищі МСі (табл. 2.1) за прописом Мурашіге і Скуга [264] з використанням модифікованої методики [6, 51, 137], яка подана в додатку А.1.
Субкультивування проводили на середовищах МС, модифікованих регуляторами росту (0-5 мг/л 2,4-Д, 1-2мг/л НОК, 0,01-0,3 мг/л кінетину). Калюсні лінії отримували в результаті субкультивування на поживні середовища МСр (див. табл. 2.1) на протязі 5-7 пасажів в залежності від генотипу.
2.3.2. Отримання бактеріальної культури для інокуляції. Біомасу E. aerogenes 30Ф брали з поверхні агару стерильною загостреною паличкою і переносили в 5 мл середовища МC-N/2 (солі за прописом Мурашіге і Скуга за винятком NH4NO3 + 5 г/л сахарози) для нарощування культури. Культивували 24 години на шейкері (120 об/хв) при температурі 24?С. Суспензію осаджували на центрифузі при 3000 об/хв, осад ресуспендірували в 10мл стерильного середовища МC-NN-сахароза. Культивували 2 години на шейкері, осаджали на центрифузі, відмивали та ресуспендірували у воді до отримання бактеріальної суспензії для інокуляції 109 кл/мл.
Таблиця 2.1
Склад поживних середовищ
для культивування рослинних і бактеріальних клітин
(макро- мікроелементи за прописом Murashige T., Skoog F. [264]), мг/л
Ком-по-
нентиХімічна формула
речовиниМСі (індукція)МСр (пасування)МС9МС9-N/2МС9-NH4NO3МС9-NNМС9-NN+KCLМАКРО-ЕЛЕМЕНТИKCl------1392*NH4NO3165016501650825*-*-*-*KNO3190019001900950*1900-*-*CaCl2 x 6H2O656656656656656656656MgSO4 x 7H2O370370370370370370370KH2PO4170170170170170170170МІКРО-
ЕЛЕМЕНТИMnSO4 x 5H2O241241241241241241241H3BO462626262626262ZnSO4 x 7H2O86868686868686KJ8,48,48,48,48,48,48,4Na2MoO4 x 2H2O2,52,52,52,52,52,52,5CoCl2 x 6H2O0,250,250,250,250,250,250,25CuSO4 x 5H2O0,250,250,250,250,250,250,25FeSO4 x 7H2O278278278278278278278Na2ЕДТА x 2H2O373373373373373373373ВІТА-
МІНИТіамін HCl1111111Піридоксин HCl0,50,50,50,50,50,50,5Нікотинова кислота0,50,50,50,50,50,50,5АКГліцин-------Лактальбумін100------РЕГУ-ЛЯТОРИ РОСТУ2,4-Д2-12*1-5*3*3*3*3*3*НОК-1-2*----Кінетин-0,01-0,5*0,3*0,3*0,3*0,3*0,3*Сахароза30000300003000030000300003000030000Агар-агар**7000700070007000700070007000Примітки:
* - авторські зміни у складі поживного середовища
** - агар-агар у рідких поживних середовищах не використовувався
2.3.3. Створення рослинно-бактеріальних асоціацій в умовах in vitro. Дослідження проводилось у 9-11 пасажах на калюсних тканин