РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
(Экспериментальная часть)
2.1. Общие замечания
Растительный материал (листья, семена, перикарпий плодов, цветочные бутоны и корни Fatsia japonica Decne. Et Planch.) собран в культивируемых насаждениях в г. Ялта.
ТСХ-анализ осуществляли на пластинках "Silufol" и "Polygram".
Препаративное разделение очищенной суммы и фракций тритерпеновых гликозидов проводили на силикагеле L (40-100 мкм), а также на микросферическом силикагеле "Silpearl".
Детектирование гликозидов и отдельных агликонов осуществляли 10%-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты. Сахара детектировали 10%-ным спиртовым раствором кислого фталата анилина. В обоих случаях хроматограммы нагревали до 100-120?С.
Использовали следующие системы растворителей: хлороформ-метанол-вода (100:40:7 и 100:30:5), хлороформ-метанол-25%-аммиак (100:40:10), (100:30:6 и 100:20:3), бензол-ацетон (4:1), хлороформ-2-пропанол (10:1>1:1), насыщенный водой, хлороформ-2-пропанол (10:1>1:1), насыщенную 10%-ным водным аммиаком, хлороформ-этанол-10%-ный водный аммиак (100:50:15), хлороформ-метанол-вода (100:40:7 и 100:30:5).
ЯМР-спектры получены на приборах "Bruker" AM-300, "Bruker" AM-400 и "Bruker" DRX-500. В качестве растворителя для ЯМР-спектроскопии использовался пиридин-d5. В качестве внутреннего эталона использовали тетраэтилсилан.
2.2. Общие химические методы
2.2.1. Щелочной гидролиз. Гликозиды растворяли в 10%-ном растворе КOH в смеси вода-метанол (1:1), нагревали в течение 2 часов при 100oС с последующим разбавлением водой, нейтрализацией водной H2SO4 до слабокислой реакции. Экстракцию прогенинов осуществляли бутанолом с последующим ТСХ анализом экстракта в системе хлороформ-метанол-вода (100:30:5) или хлороформ-метанол-аммиак (100:30:6).
2.2.2. Полный кислотный гидролиз. Для определения сахаров полный кислотный гидролиз осуществляли путем растворения гликозидов в смеси диоксан-4 н водная CF3COOH (1:1) при 100oС в течение 2 часов. Сахара в гидролизате без предварительной обработки идентифицировали ТСХ на пластинках "Silufol" в системах растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7) или хлороформ-метанол-25%-ный водный аммиак (100:40:10) с заведомо известными образцами сахаров - глюкозы, арабинозы, галактозы, рамнозы, глюкуроновой кислоты, ксилозы. Для идентификации агликонов полный кислотный гидролиз осуществляли путем растворения гликозидов в смеси метанол-2 н водная H2SO4 с последующим нагреванием в течение 2 часов при 100oС. Далее полученный гидролизат разбавляли 3-х кратным объемом воды и экстрагировали агликоны хлороформом. Идентификация агликонов осуществлялась с использованием ТСХ в сравнении с заведомыми образцами в системах растворителей хлороформ-метанол-25%-ный аммиак (100:20:3) или бензол-ацетон (4:1).
2.2.3. Частичный кислотный гидролиз. К 1 мг гликозида добавляли 0,1 мл диоксана и 0,1 мл 2 н водного раствора трифторуксусной кислоты и нагревали в течение 15-20 минут при 100oС. Прогенины экстрагировали бутанолом, насыщенным водой. Бутанольный экстракт анализировали при помощи ТСХ в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7). Агликон идентифицировали путем сравнения с заведомо известными образцами гликозидов.
2.2.4. Ферментативный гидролиз препаратом из семян плюща. К небольшому количеству гликозида (5-10 мг) добавляли 10 мг препарата, смачивали сухую смесь фермента и гликозида дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Выдерживали в течение 4 часов при температуре 40oС. Продукты ферментолиза экстрагировали 2 мл н-бутанола и анализировали ТСХ в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7).
2.2.5. Дезацилирование. Дезацетилирование проводили с использованием 10%-ного водно-спиртового раствора аммиака в течение 3 часов при комнатной температуре, с последующей нейтрализацией катионитом (КУ-2-8) в Н+- форме. Анализ продуктов проводили ТСХ в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7).
2.2.6. Боргидридное восстановление. 10 мг гликозида растворяли в 2 мл безводного метанола с добавлением 100 мг NaBH4 и выдерживали в течение 10 часов при комнатной температуре с постоянным перемешиванием. Степень полноты восстановления контролировали с помощью ТСХ. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток растворяли в бутаноле, насыщенном водой, троекратно промывали водой, бутанольный слой упаривали досуха и анализировали ТСХ.
2.2.7. Метилирование диазометаном. Метилирование проводили путем добавления к гликозиду, растворенному в 90%-ном водном метаноле, избытка эфирного раствора диазометана до появления устойчивой желтой окраски. После упаривания остаток анализировали ТСХ.
2.3. Выделение, разделение и очистка сапонинов из различных органов фатсии японской
2.3.1. Выделение гликозидов из семян. Семена в количестве 15,0 г, троекратно обезжиривали бензолом (3 раза по 150 мл) и трижды экстрагировали 80% водным 2-пропанолом (3 раза по 200 мл).
После упаривания объединенных спиртовых экстрактов получили 4,9 г сухого остатка, который растворяли в 400 мл бутанола насыщенного водой и дважды промывали порциями по 100 мл 5%-ного водного аммиака. В результате упаривания бутанольного экстракта получили 3,0 г очищенной суммы тритерпеновых гликозидов.
Полученную очищенную сумму разделяли хроматографически на силикагеле (200 г) при градиентном элюировании системой растворителей хлороформ-2-пропанол (10:1>1:1), насыщенной водой. В результате разделения получили 11 фракций, обозначенных в порядке увеличения их полярности: S-A (105 мг), S-B (820 мг), S-C (10 мг), S-D (160 мг), S-E (50 мг), S-F (750 мг), S-G (100 мг), S-H (100 мг), S-I (60 мг), S-J (250 мг), S-K (35 мг).
По данным ТСХ фракции S-A, S-B, S-E, S-G, S-H, S-K являются индивидуальными тритерпеновыми гликозидами, а фракции S-D, S-F, S-I, S-J представляют собой смеси близких по полярности гликозидов.
В результате рехроматографирования фракции S-D на микросферическом силикагеле "Silpearl" в системе раст