Розділ 2. Загальна методика та основні методи досліджень.
2.1. Обгрунтування та завдання досліджень.
Відповідно до поставлених завдань для досягнення мети нам необхідно будо
розробити відповідну модель та підібрати оптимальні співвідношення чинників, за
впливу яких моделюватиметься стан штучного вуглекислотного гіпобіозу у кролів.
У дослідах використовували кролів – самців масою 2.5-3кг. Тварин утримували у
віварії Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини якості і безпеки
продукції АПК на стандартному раціоні.
Експериментальну частину роботи було поділено на такі основні етапи:
1. Розробка моделі формування стану штучного вуглекислотного гіпобіозу у
кролів. Визначення оптимальнного співвідношення таких чинників гіпобіозу як
концентрація вуглекислого газу та кисню у суміші для дихання, температура
холодильної камери і тривалість їх дії для введення кролів у стан гіпобіозу за
змінами основних фізіологічних показників.
2. Дослідження впливу СО2 та О2 на динаміку формування стану штучного
вуглекислотного гіпобіозу за фізіолого-біохімічними параметрами. З метою
з’ясування впливу газової суміші для дихання при моделюванні штучного
гіпобіозу, досліджувався вплив лише холодового чинника.
3. Визначення вмісту інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот в
крові у динаміці формування у кролів стану штучного вуглекислотного гіпобіозу.
Вміст досліджуваних метаболітів визначали методами ферментного аналізу.
4. Дослідження показників кислотно-лужної рівноваги за гіпобіозу. Визначення
проводили на аналізаторі газів крові типу ОР-215 угорської фірми “Radelkis”.
5. Визначення метаболітів азотового обміну в крові при моделюванні гіпобіозу.
Визначали вміст аміаку, на аналізаторі Microlab – 200 (Нідерланди) кількість
сечовини в сироватці та креатиніну в плазмі крові, фонд вільних амінокислот
методом рідинної іонообмінної хроматографії на амінокислотному аналізаторі ААА
Т 339М виробництва фірми MICROTECHNA-PRAHA (Чехія ).
6. Визначення вмісту проміжних продуктів гліколізу та циклу трикарбонових
кислот в печінці кролів у стані гіпобіозу. Вміст метаболітів визначали
ферментативними методами аналізу.
7. Визначення активності ферментів кролів у стані гіпобіозу. Активність
ферментів досліджували спектрофотометрично за інтенсивністю поглинання NAD+ та
NADН при 340 нм.
8. Визначення вмісту нікотинамідних коферментів за гіпобіозу.Визначення
проводили ферментативними методами аналізу.
Одержані результати були опрацьовані методами варіаційної статистики та за
допомогою комп`ютерної програми Microsoft Exel.
2.1. Відбір матеріалу та підготовка його для досліджень.
Для розробки моделі формування стану штучного вуглекислотного гіпобіозу у
кролів визначали оптимальне співвідношення таких чинників гіпобіозу як
концентрація вуглекислого газу та кисню у суміші для дихання, температура
холодильної камери і тривалість їх дії для введення кролів у стан гіпобіозу за
змінами основних фізіологічних показників: температури тіла, частоти серцевих
скорочень та кількості дихальних рухів за 1 хв. Для ввеведення тварин у стан
штучного гіпобіозу їх вміщували у холодильну камеру, подаючи через наркозну
маску газову суміш, яку моделювали за допомогою змішувача газів 122СГ-01.
При дослідженні фізіологічних параметрів температуру тіла дослідних тварин
вимірювали у прямій кишці електронним термометром, кількість серцевих скорочень
визначали за даними електрокардіограми на електрокардіографі ЭК1К-01, частоту
дихальних рухів визначали за коливаннями черевної стінки.
Для визначення вмісту інтермедіатів гліколізу та циклу трикарбонових кислот в
крові у динаміці формування у кролів стану штучного вуглекислотного гіпобіозу
методами ферментного аналізу кров у дослідних тварин відбирали з вени вуха
через 1.5 годин після початку досліду (початок входженя тварин у стан штучного
гіпобіозу), через 3 години (коли тварини перебували у гіпобіозі), та через 1
годину після припинення дії чинників гіпобіозу. Через відповідні проміжки часу
відбирали кров у дослідної групи, що перебувала у холодильній камері. Відібрану
кров змішували з 6 % розчином HСlO4 у співвідношенні 1:4, надосадову фракцію
використовували для визначення вмісту метаболітів.
Для дослідження показників кислотно-лужної рівноваги у кролів відбирали кров з
вени вуха у гепаринізовані капіляри та негайно досліджували на аналізаторі
газів крові типу ОР-215 угорської фірми “Radelkis”.
Для визначення вмісту вільних амінокислот методом рідинної іонообмінної
хроматографії на амінокислотному аналізаторі ААА Т 339М виробництва фірми
MICROTECHNA-PRAHA (Чехія ) сироватку крові осаджували 3% розчином
сульфосаліцилової кислоти у співвідношенні 1:1.
Визначення вмісту проміжних продуктів гліколізу та циклу трикарбонових кислот
в печінці кролів у стані гіпобіозу. Тварин знеживлювали декапітацією, для
визначення вмісту метаболітів печінку негайно вилучали, розтирали у скрапленому
азоті та готували безбілкові екстракти в 6 % хлорній кислоті 1:7. В екстрактах
після нейтралізації, використовуючи ензиматичні методи аналізу, визначали
концентрацію пірувату, лактату, малату, оксалоацетату, глутамату,
а-кетоглутарату [6].
Цитозольну фракцію печінки отримували методом диференційного центрифугування
гомогенату печінки у 0,25 М сахарозі, що містить 6 мМ ЕДТА при 105000 g
протягом 60 хв. В цитозольній фракції визначали активність лактатдегідрогенази
[10], малатдегідрогенази [116, 204], ізоцитратдегідрогенази[206],
альдегіддегідрогенази [79], алкогольдегідрогенази [79] спектрофотометрично за
інтенсивністю поглинання NAD+ та NADН при 340 нм.
Визначення вмісту нікотинамідних коферментів проводи
- Київ+380960830922