Раздел 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы исследований
Материалами исследований служили сывороточный альбумин, цитохром с и супероксиданиондисмутаза. В предварительных опытах использовался препарат альбумина, полученный стандартным методом спиртового осаждения с последующей лиофилизацией, который любезно предоставлен Республиканской станцией переливания крови. Исследования проводили также с применением коммерческих препаратов бычьего сывороточного альбумина и цитохрома с дрожжей. Лиофильные электрофоретически гомогенные препараты бычьего сывороточного альбумина, предназначенные для аналитических исследований, а так же лиофильный электрофоретически гомогенный препарат цитохрома с (окисленная форма) и СОД были любезно предоставлены научно-производственной компанией "Биоритм" (Украина). Водные растворы цитохрома с характеризовались максимумом поглощения полосы Соре 408-409 нм. Хроматографически гомогенный препарат ретинолацетата синтезирован и любезно предоставлен для исследований кафедрой органической химии Таврического национального университета. Так же использовались коммерческие препараты 1-[4-[2-(диметиламино)-этокси]-фенил]-транс-1,2дифенил-1бутена (коммерческое название - тамоксифен) и хлороформа.
2.2. Общая организация экспериментальной части
Экспериментальная часть данной работы проведена на кафедре биохимии Таврический Национальный университет им. В. И. Вернадского.
Эксперименты проводились тремя сериями. Задачей первой серии было изучение влияния низкочастотных МП на динамику структурных изменений белковых молекул в водном растворе.
В ходе второй серии оценивалось влияние МП на структуру белков в условиях воздействия слабого дестабилизирующего фактора - хлороформа.
В третьей серии - изучалось влияние МП на функциональную активность белков: способность альбумина к связыванию лигандов - ретинолацетата и тамоксифена, и способность цитохрома с участвовать в окислительно-восстановительных реакциях.
Перед проведением экспериментов и на протяжении всех экспериментальных серий осуществлялся контроль внешних условий (освещение, температура, электромагнитный фон лаборатории).
2.3. Методы воздействия ПеМП на исследуемые образцы
Во всех проводившихся экспериментах опытные пробы, подлежащие воздействию магнитного поля, помещались в экспериментальную установку (см. рис. 2.1), состоящую из трёх взаимноперпендикулярных пар квадратных колец Гельмгольца в квазиконфигурации размером 0,5?0,5?0,5м. Такое устройство позволяло полностью контролировать направление колебаний вектора МП.
Рабочая область, в пределах которой неоднородность магнитного поля не превышает 10%, расположена в центре колец и занимает объем около 0,2?0,2?0,2 м. Воздействие велось импульсным магнитным полем частотой 8 Гц, индукцией 25 ?Т, импульсы имели прямоугольную форму. Вектор напряженности создаваемого поля располагался в горизонтальной плоскости и был перпендикулярен горизонтальной составляющей (Н) геомагнитного поля, которое на широте Симферополя составляет 27,5 мкТл. Контрольные пробы находились в условиях фоновых значений ПеМП, характерных для данной лаборатории (20-65 нТл).
Рис 2.1 Блок-схема организации магнитобиологических экспериментов. 1 - экспериментальная установка (а - генератор сигналов специальной формы Г6-29; б - система колец Гельмгольца; в - рабочая зона установки); 2 - микротесламетр Г-79; 3 - система контроля магнитной обстановки (а - датчик MVC-2; б - АЦП; в - лабораторная ЭВМ); 4 - изолированный объём для размещения контрольных проб.
Проведение опытов по выявлению влияния слабого фактора, каковым является низкочастотное переменное МП малой интенсивности, требует учёта и минимизации всех, стохастических и систематических помех, могущих служить источниками артефактов. С этой целью в экспериментальной лаборатории проводился контроль температуры, освещённости и электромагнитного фона.
Суточные колебания температуры в период проведения отдельных экспериментов не превышали ±0,8оC относительно среднесуточного уровня. Освещение лаборатории осуществлялось при помощи рассеянного излучения ламп дневного света.
Рис 2.2 Электромагнитная обстановка экспериментальной лаборатории: А) дневной фон на уровне 1,5 м, генератор включен; Б) дневной фон на уровне 0,75м, генератор включен; В) дневной фон на уровне 1,5м, генератор отключен;
Рис 2.2 (продолжение) Г) дневной фон на уровне 0,75м, генератор отключен; Д) вечерний фон на уровне 1,5м, генератор отключен; Е) вечерний фон на уровне 0,75м, генератор отключен; Ж) вечерний фон на уровне 1,5м, генератор включен; З) вечерний фон на уровне 0,75м, генератор включен;
Примечание интенсивность электромагнитного фона дана в мкТл. Экспериментальный объём размещается на высоте 1,5м, (точка 3-3) контрольный объём - на высоте 0,75м. (точка 2-1).
Особое внимание обращали на электромагнитный фон лаборатории. Известно [130], что в каркасе железобетонных зданий с развитой электропроводкой могут образовываться достаточно интенсивные вихревые токи, являющиеся источником фоновых ЭМП, которые могут влиять как на экспериментальные образцы, так и на работу регистрирующей аппаратуры. В связи с этим осуществляли контроль электромагнитной обстановки при помощи датчика MVC-2, а так же микротесламетра Г-79. По результатам замеров были построены карты электромагнитного фона лаборатории - в зависимости от времени суток (см. рис. 2.2).
С целью оценки возможного влияния неучтённых различий в уровне фоновых ЭМП в местах расположения опытных и контрольных образцов проводили эксперименты с ложным воздействием МП. В этом случае опытные образцы помещали в кольца Гельмгольца, но не подвергали воздействию МП.
В связи с тем, что для исследования временной динамики оптических характеристик нативных белков требовалось регистрировать их оптическую плотность не прерывая воздействия ПеМП на образец, для данной экспериментальной серии была использована отдельная установка. Эта установка включала в себя двойную (для спектрофотометрического контроля и экспериментальной пр