Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Характеристика реактивів
Агар-агар Duchefa, Нідерланди
Агароза Sigma, США
L-аспарагінова кислота Serva, ФРН
БАП Duchefa, Нідерланди
Бензидин Serva, ФРН
Бичачий сироватковий альбумін Serva, ФРН
5-бромо-4-хлоро-3-індоліл-?-D-глюкуронід Sigma, США
Глiцерин Serva, ФРН
2,4-Д Duchefa, Нідерланди
Дезоксинуклеотидтрифосфати Pharmacea, Швеція
ДМСО Serva, ФРН
ДТТ Serva, ФРН
ЕДТА Sigma, США
Жовта кров'яна сіль Serva, ФРН
Зеатин Duchefa, Нідерланди
ІОК Duchefa, Нідерланди
Канаміцин-сульфат Курганський завод
медпрепаратів, Росія
?-кетоглутарова кислота Serva, ФРН
Кінетин Duchefa, Нідерланди
Маркер молекулярної ваги 1 Kb GibcoBRL
Маркер молекулярної ваги 1 Kb Plus GibcoBRL
МЕС Duchefa, Нідерланди
МКЕ Serva, ФРН
НАД Serva, ФРН
НОК Duchefa, Нідерланди
Піридоксаль-5-фосфат Serva, ФРН
Поліетиленгліколь 4000 Duchefa, Нідерланди
Рестрикційні ендонуклеази Fermentas, Литва
RAPD-праймери Operon Technology Inc.
Стiйкий синій РР-сіль Serva, ФРН
Taq-полімераза Promega
Тетразолієвий синій Serva, ФРН
Трис-HCl Sigma, США
Тривкий фіолетовий Serva, ФРН
Тритон Х-100 Sigma, США
Феназинметасульфат Serva, ФРН
Фосфінотрицин Duchefa, Нідерланди
Ферменти:
"Driselase", "Macerase" Sigma, США
"Onozuka R-10" Serva, ФРН
Червона кров'яна сіль Serva, ФРН
Щавелева кислота Serva, ФРН
Яблучна кислота Serva, ФРН
Для приготування живильних середовищ використовували неорганічні солі, цукри, вітаміни та амінокислоти вітчизняного виробництва зі ступенем очищення "осч" фірма "Альфарус". Ацетон, етанол, йод, крохмаль, метанол, оцтова кислота, перекис водню, використані при біохімічних аналізах, вітчизняного виробництва зі ступенем очищення "хч" фірма "Альфарус".
2.2. Рослинний матеріал
В роботі було використано асептичні рослини різних видів родини Brassicaceae.
1. Рослини дикого типу гірчиці сарептської Brassica juncea (L.) Czern. & Coss. сорту Green in Snow, насіння було люб'язно надано доктором Anil Day (Manchester University, UK).
2. Рослини дикого типу ярого ріпаку (Brassica napus L.), сортів Westar (насіння якого було отримане з двох різних джерел - від к.б.н. Радчука В. та к.б.н. Гірича А.М.) та Калинівський (люб'язно надане д.б.н., проф. Пересипкіним В.Ф.).
3. Рослини дикого типу Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz, надані д.б.н., академіком Глебою Ю.Ю.
4. Рослини Arabidopsis thaliana L., трансформовані плазмідами pIC401 (рис. 2.1.) або pIC411. Відмінність між плазмідами полягає в тому, що в pIC411 Spm-транспозаза знаходиться під своїм власним промотором, а в pIC401 - під 35S промотором. Насіння арабідопсису було люб'язно надано фірмою "Icon Genetics GmbH" (ФРН).
Рис. 2.1. Схема Т-ДНК плазмідного вектора pIC 401, використаного для трансформації A.thaliana. LB і RB граничні послідовності Т-ДНК; bar - ген стійкості до фосфінотрицину, оточений послідовностями неавтономного мобільного елемента dSpm; nptII - ген неоміцинфосфотрансферази II; SpmTРase - ген іммобілізованої Spm-транспозази; gusA - ген b-глюкуронідази, маркер процесу транспозиції.
Насіння B.juncea, B.napus та O.violaceus стерилізували 2 хв у 70% етанолі та 15 хв у комерційному розчині "Білизна". Насіння A.thaliana витримували 1 хв в 70% етанолі і 5 хв у розчині "Білизна". Після стерилізації матеріал тричі відмивали в стерильній дистильованій воді, підсушували на фільтрувальному папері та висівали на тверде живильне середовище В5 [193]. Насіння пророщували при температурі 25?C, освітленості 3000 лк, фотоперіоді - 16 год. Надалі асептичні росли