РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ТА УМОВИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Загальні положення
Метою роботи була розробка методики мікророзмноження селекційних зразків моркви
та застосування її разом з експериментальною гаплоїдією у схемах створення
чоловічостерильних ліній моркви для гетерозисної селекції.
Дослідження проводили в Інституті овочівництва і баштанництва УААН протягом
1993 – 2004 років.
Об’єктом досліджень служила морква м’ясиста - Daucus carota L., subsp. сarota
(підвид європейський), convar. sativus (Hoffm) Setch (культурна); - родина
Селерових - Apiaceae Lindl. або ж Зонтикових - Umbrelliaceae Moris [114].
У дослідженнях були використані селекційні зразки та індивідуальні добори
моркви, що мали необхідні для створення ЧС-ліній цінні ознаки (додаток И).
Серед цих властивостей чоловіча стерильність типів петалоїд та браун,
закріплення стерильності, підвищений вміст в-каротину, стійкість проти
патогенів, продуктивна архітектоніка насіннєвого куща та інші.
Вихідні рослини були вирощені в селекційних розсадниках та в розсаднику
розмноження еліти у незахищеному та захищеному ґрунті.
Дослідження рослинних об’єктів у культурі in vitro проводили за
загальноприйнятими методиками [77, 115, 116, 150]. Операції, що вимагали
стерильних умов, виконували у ламінарному боксі КПГ-1М. Приміщення та бокс
дезинфікували бактерицидними лампами протягом двох годин. Для роботи
використовували пінцети малий та середній, скальпелі малий та середній
спеціальну довгу металічну петлю.
Базовою методикою досліджень з розробки ефективної методики мікроклонування
селекційних зразків моркви служила процедура одержання соматичних ембріоїдів у
калюсній культурі, викладена у роботах [54, 89].
Використовували наступні органи рослин моркви: нерозкриті бутони, листки
обгорток зонтиків, молоді листки рослин першого року життя, коренеплоди,
насіння.
Об’єкти культивували на штучних агаризованих та рідких живильних середовищах у
скляних флаконах розміром 2 х 6 см та в пробірках розміром 2 х 18 см. На рідких
живильних середовищах об’єкти розміщували за допомогою місточків з
фільтрувального паперу. Пробірки та флакони з об’єктами закривали алюмінієвою
фольгою з товщиною 12 мкм.
Культивували рослинний матеріал in vitro у термостаті та у спеціально
обладнаній культуральній кімнаті, де освітлення забезпечували за допомогою
люмінесцентних ламп. Фотоперіод у всіх дослідах становив 16 годин на добу.
Дигаплоїдні рослини моркви створювали за методикою індукції гіногенезу в
культурі in vitro Тюкавіна Г.Б., Шмикової Н.А. [7-12]. Згідно цієї методики
бутони моркви культивували протягом двох тижнів у темноті на індуктивному
середовищі MSM з 0,2 мг/л 2,4-Д. Потім з них виділяли насіннєзародки і
культивували на середовищі того ж складу до утворення ембріогенного калюсу.
Ембріоїди переносили на регенераційне середовище MSM з 0,1 мг/ кінетину, де
одержували проростки з первинних або вторинних ембріоїдів. Дорощування та
вкорінення рослин-регенерантів проводили на безгормональному середовищі MSM.
Обліки результатів досліджень у культурі in vitro проводили візуально через
30-50 днів культивування об’єктів.
Дослідження рослин-регенерантів моркви проводили в умовах захищеного і
незахищеного грунту.
Визначення вмісту в-каротину у звичайних та одержаних шляхом мікророзмноження
коренеплодах моркви проводили згідно [151].
Математичну обробку одержаних даних проводили за [117, 118].
2.2. Розробка ефективної методики мікроклонування селекційних зразків моркви
2.2.1. Дезинфекція рослинного матеріалу. Мета досліджень полягала у визначенні
оптимального режиму поверхневої дезинфекції рослинного матеріалу моркви.
В сучасних умовах найбільш доступним, дешевим і малотоксичним асептиком є
комерційний. препарат “Білизна”, діючою речовиною якого є гіпохлорит натрію
(NaOCL). У дослідженнях визначали оптимальні режими застосування його як
асептичного агента для поверхневої обробки рослинного матеріалу моркви.
Об’єктами досліджень були нерозкриті бутони довжиною 1 мм з рослин сорту
Нантська харківська та насіння генотипу 111,вирощені у польових умовах.
Антисептичний препарат застосовували у таких об’ємних концентраціях: для
бутонів – 25, 33, 50 %; для насіння – 50 %.
Експозиції обробки: для бутонів становили 15, 20 і 30 хв., а для насіння – 20 і
40 хв. Експозицію 15 хв. застосовували як з попередньою обробкою бутонів 70 %
етанолом протягом 1 хв., так і без неї.
Насіння у всіх варіантах попередньо занурювали у 96 % етанол на 1 хв. Після
стерилізації об’єкти промивали 5 разів автоклавованою дистильованою водою. Щоб
запобігти втраті рослинного матеріалу при стерилізації, його вкладали у марлеві
мішечки.
Для культивування об’єктів застосовували поживне середовище, що містило солі та
вітаміни за МS, 3 % сахарози і 0,7 % агару “Serve”. Бутони розміщували по 4-6
шт. у флакон, а насіння – по 2-4 шт. у пробірку. Протягом перших 6 днів об’єкти
витримували у темряві при температурі 28єС, потім – при освітленні 4000 лк і
температурі 22-25єС.
_____________________
Примітка. 1. Тут і далі номери генотипів подаються за біотехнологічним
каталогом (див. додаток И)
У кожному варіанті досліджень використовували від 50 до 170 об’єктів.
Кількість інфікованих об’єктів визначали через 10 днів.
Критерієм життєздатності бутонів слугував показник “довжина бутону”, який
визначали після 30 днів культивування.
2.2.2. Індукція та проліферація калюсу моркви in vitro. Мета досліджень
полягала у виявленні оптимального складу живильного середовища, що забезпечило
б максимальне утворення та ріст калюсів моркви більшості генотипів.
Визначення оптимальної концентрації ауксину 2,4-
- Київ+380960830922