ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Биологическое моделирование эксперимента.
Эксперименты выполнены на половозрелых крысах самцах, массой 120-180 г,
разводки вивария Института экспериментальной патологии, онкологии и
радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины. Всего в работе использовано 890
животных. Гепатоканцерогенез индуцировали НДЭА “Sigma”, который животные
опытной группы получали как 0,01% раствор с питьевой водой в дозе 10 мг на кг
массы тела до появления в печени макроскопических опухолевых узлов. Контрольную
группу составляли интактные животные (n =192). Объектом исследования являлись
микросомы из печени опытных и контрольных животных в следующие сроки
исследования: 0,5; 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 42, 56, 70, 84, 112, 146, 250
суток.
Индукторы CYP: фенобарбитал (80 мг/кг), этанол (1.2 г/кг) и 3-метилхолантрен
(15 мг/кг) вводили 1 раз в день в течение трех дней, как водный раствор (ФБ и
ЭТ) и масляный раствор (3-МХ) [80, 81].
Модификацию канцерогенеза проводили 15-кратным пероральным введением РА в дозе
53МЕ/кг массы тела [82] и АК в дозе 40 мг/кг массы тела [83].
Все манипуляции с животными проводили согласно Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, которые используются для экспериментальных научных
целей.
2.2. Выделение фракции микросом из ткани печени и гепатом крыс.
Для уменьшения количества гликогена и стабилизации состава микросом животных не
кормили в течение 20-24 часов до опыта. Все процедуры выделения проводили при
температуре 4°С. После гексеналового наркоза
животных декапитировали, вскрывали брюшную и грудную полости. В верхнюю полую
вену вводили иглу и перфузировали печень до светло-желтого цвета средой
выделения, содержавшей 0.15М КСl, 0.5 мМ EDTA, 5мМ Трис-HCl буфер (рН-7.4).
После перфузии печень удаляли, взвешивали и гомогенизировали в гомогенизаторе
Поттера в соотношении ткани и объема среды 1/10. Для осаждения не разрушенных
клеток, ядер и митохондрий, гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при
10 000g (ротор SW-28, центрифуга L-5-65 "Beckman"). Затем надосадочную жидкость
центрифугировали в течение 60 минут при 105 000g (ротор SW-28, центрифуга
L-5-65 "Beckman"). Микросомы отмывали от сорбированных немембранных белков и, в
частности, гемоглобина в течение 60 минут при 105 000 g в среде, содержащей 100
мМ пирофосфат натрия рН 7.4. Осадок суспендировали в 100 мМ К-фосфатном буфере
рН 7,4, содержащем 1 мМ EDTA, 1 мМ ДТТ, 20% глицерин и 100 мМ КС1.
Степень чистоты микросомальной фракции оценивали на основании данных
электронной микроскопии, активности маркерных ферментов: глюкозо-6-фосфотазы,
5' нуклеотидазы, цитохром-с-оксидазы и ЭПР-спектроскопии. В препаратах МК белки
плазматической мембраны составляли 3-4% от общего микросомального белка, 2,5 -
3% - белки наружной и внутренней мембраны митохондрий, а остальная часть (то
есть более 90%) представлена мембранами эндоплазматической сети. Эти данные
совпадают с данными литературы и свидетельствуют о том, что выделенная нами
общая микросомальная фракция содержит все структурные элементы, а указанное
выше количество примесей не будет вносить существенный вклад в исследуемые
биохимические и биофизические параметры [12, 84].
2.3 Определение содержания окисленной формы CYP методом ЭПР
Регистрацию спектров ЭПР микросом из печени, ткани опухоли, а также ткани
прилежащей к опухоли, осуществляли на радиоспектрометре Е-109 "Varian" (США)
при температуре 77°К. Запись спектра исследуемого объекта проводили при
следующих условиях: рабочая частота 9200-9300 Мгц, диапазон сканирования
магнитной индукции 0-4 Тл, частота модуляции - 100 Кгц, амплитуда модуляции -
0,8 мТл, мощность СВЧ - 5 мвт. Относительное содержание окисленного
(феррицитохрома) Р-450 во всех биологических образцах оценивали по амплитуде
линии поглощения с g-фактором 2.25. Динамика изменения интенсивности
исследуемых сигналов в образцах представлена в виде отношения величины
амплитуды сигнала ЭПР в опыте к соответствующей амплитуде сигнала в контроле.
На каждую экспериментальную точку брали образцы ткани от 9 животных.
2.4 Определение количества цитохрома b5, общего CYP и его неактивной формы
цитохрома Р-420 в микросомах.
Определение проводили методом оптической дифференциальной спектрофотометрии на
двухлучевом спектрофотометре Hitachi -554 по методу [85]. Инкубационная смесь
содержала 100 мМ К-фосфатный буфер рН 7.6 и 1-2 мг микросомального белка. В обе
кюветы вносили по 2,5 мл взвеси исследуемого белка МК и прописывали нулевую
линию в диапазоне от 400 до 500 нм. Затем в опытную кювету добавляли дитионит
натрия и в диапазоне от 400 до 500 нм регистрировали спектр поглощения
цитохрома b5. После этого в обе кюветы добавляли несколько кристалликов
дитионита натрия и в опытной кювете в течение 1 минуты проводили насыщение
окисью углерода, которую получали при смешивании муравьиной и серной кислот,
очищали пропусканием через раствор пирогаллола и регистрировали
дифференциальный спектр поглощения цитохрома Р- 450 и Р-420.
Содержание цитохрома b5 рассчитывали по формуле:
N= Е 424-408 х Vc / Va x Ex,
где N - количество цитохрома b5 в нмоль/мг;
Е - разность оптической плотности между 424 и 408 нм;
Ex - коэффициент молярной экстинции цитохрома b5 (165 мМ-1 см -1),
Vc - объем смеси;Va - объем добавляемой аликвоты МК.
Рис.2.1. Оптические спектры CYP, Р-420 и b5 в микросомах гепатомы и печени.
I - микросомы гепатомы, II - микросомы печени
Содержание CYP определяли по формуле:
N= E 450-490 х Vc / Va х Ех,
где N - количество CYP в нмоль/мл,
Е - разность оптической плотности между 450 и 490 нм,
Ех - коэффициент молярной экстинции цитохрома Р- 450 (
- Київ+380960830922