РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Реактиви і препарати
В роботі було використано агарозу марок Low EEO – “Sigma” ( США ), DNA –
“Merck” (Німеччина) та “ Bio-Rad” (США), бромистий етідій, бромфеноловий синій,
натрієву сіль етилендіамінтетраоцтовової кислоти (Na-EDTA), додецил-сульфат
натрію (SDS), трис-гідроксіметиламінометан (трис-НCL), набір реагентів для
виділення РНК ( RNAqueous TM Small Scale Phenol-Free Total RNA Isolation Kit )
“Ambion” (США), набір реагентів для RT-ПЛР (RETROscriptTM First Strand
Synthesis Kit for RT-PCR ) “Ambion” (США), набір реагентів для очистки
продуктів ПЛР (UltraCleanTM PCR Clean-up Kit ) Mo Bio Laboratories, Inc.;
ферменти: панкреатична РНК-аза (вільна від ДНК-аз), протеіназа К фірми “Sigma”
(США), ендонуклеази рестрикції фірм “Sigma” (США) та “Fermentas” (Литва),
ДНК-лігаза Т4 “Sigma” (США), Taq ДНК-полімераза “Sigma” (США); реакційна суміш
для ПЛР “Sigma” (США); суміш дезоксінуклеотидів (dNTP), 10мМ розчин, “Sigma”
(США) ; праймери (табл. 2.1) синтезовано фірмою Синтол (Росія).
Таблиця 2.1
Праймери, які використані у дослідженні
Праймери
Послідовності
рА
5’– AGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’
рН
3’–AAGGAGGTGATCCAGCCGCA–5’
РЕН-С
5'-GATACGGAGTATGCCTTTACGGTG-3'
PEH-D
5'-TAGCCTTTATCAAGCGGATACTGG-3'
Також в роботі було використано комерційні реагенти та розчинники кваліфікації
“осч” і “хч” вітчизняного виробництва. Для приготування розчинів
використовували деіонізовану воду.
2.2. Штами бактерій і їх вирощування
В роботі було використано бактеріальні штами: Klebsiella oxytoca ІМБГ 26,
Pseudomonas fluorescens ATCC 13525, P. aureofaciens ІМБГ 228, Pseudomonas sp.
ІМБГ 168 , Pseudomonas sp. ІМБГ 163, Agrobacterium sp. ІМБГ 260 (всі із
колекції відділу), Pantoea agglomerans 1a (люб’язно наданий д.б.н., проф. Р. І.
Гвоздяком, Інститут мікробіології і вірусології НАН України), які вирощувалися
в стандартних умовах: на агаризованому середовищі LB [119] у термостаті при
температурі 28 0C або в рідкому LB у режимі постійного перемішування за тієї ж
температури.
Для вирощування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 використовували модифіковане
середовище Ешбі (рідке і агаризоване) [120] у нашій модіфікації, яка стосувться
заміни Ca CO3 на цеоліт, такого складу (г/л):
K2HPO4 – 1;
MgSO4 Ч7H2O - 0,2;
сахароза – 10;
цеоліт – 0,35, рН 7,0.
Для приготування поживного середовища всі сухі компоненти, окрім MgSO4Ч7H2O,
змішують у колбі і розчиняють у воді. Перевіряють значення рН і, за
необхідністю доводять концентрованим NaOH перед автоклавуванням, оскільки
перевірка показала, що процес стерилізації лишає рН незмінним. Розчин MgSO4
готують окремо, автоклавують і додають у стерильне поживне середовище перед
використанням. Такі заходи запобігають випадінню солей у нерозчинний осад за
процесу автоклавування.
Для визначення оптимальних умов культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156,
перевірки її сумісності з потенційними бактеріями-партнерами і одержання
екзополісахариду, використовувалося мінеральне середовище А-3 [106] (рідке і
агарове) у нашій модифікації – введенням у його склад цеоліта (г/л):
KNO3 – 1,75;
MgSO4Ч7H2O – 1,3;
Na2HPO4Ч12 H2O – 1, 4;
цеоліт – 0,35;
сахароза –10; pH 7,0
Умови приготування такі самі, що і середовища Ешбі.
Для визначення оптимальних умов культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156, як
складника бактеріальної системи використовували рідке поживне середовище у
нашій модифікації А-3. Відмінність від попереднього складу полягала в
збільшенні кількості цеоліту до 1% і сахарози до 10 г/л.
Спільне культивування Paenibacillus sp. ІМБГ 156 з бактеріями-партнерами
проводили на мінеральному середовищі МZ (г/л):
KNO3 – 1,75;
MgSO4Ч7H2O – 1,3;
Na2HPO4Ч12 H2O – 1,4;
цеоліт – 10;
сахароза – 20; pH 7,0, яке було приготовлене за тих самих умов. Поживні
середовища стерилізували автоклавуванням у режимі 0,5 атм., 120 0C, 30 хв.,
цеоліт подвійною стерилізацією: автоклавуванням (1,5 атм, 125 0С, 40 хв) з
подальшим прожарюванням у сухожаровій шафі на протязі 4 год. при 170 0С.
2.3 Виділення природних ізолятів екзополісахаридсинтезувальних бактерій з
цеоліту і креміню
Природні ізоляти силікатних (слизових) бактерій виділяли з цеоліту – мінералу,
що видобувається у селищі Сокирниця (Закарпатська область, Україна) та кременю
(Хмельницька область, Україна). 1г цеоліту (фракція 5.0 мм) поміщали у
середовище А-3 (без цеоліту) і інкубували у термостаті при 28 0С на протязі 7
діб. Отриману таким чином накопичувальну культуру висівали на агаризоване
середовище Ешбі методом серійних розведень. Виділення бактерій з кременю
проводили за такою ж самою схемою. Одержання слизових бактерій у чистій
культурі, які за фенотипом збігалися з описом, наданим В. Г. Александровим
[106], було проведено за традиційним методом виділення чистих культур бактерій
[121], тобто шляхом поступових розсівів за застосування методу серійних
розведень. Виділені штами пасувались на агаризованому середовищі Ешбі.
2.4. Встановлення культурально-морфологічних і фізіолого- біохімічних ознак
штаму 1
Визначення культурально-морфологічних і фізіолого-біохімічних ознак штама 1
проводили за традиційними мікробіологічними методами, описаними Т.В.
Аристовською з співавторами [122] і З.Е. Теппер з співавторами [121].
Культуральні ознаки ізоляту 1 визначали вирощуванням на рідких і агаризованих
середовищах А-3 і Ешбі у термостаті при температурі 28 0С.
Морфологію бактеріальних клітин: форму, їхній розмір, відношення до забарвлення
по Граму визначали за допомогою світлового мікроскопу. Тип дихання – посівом у
товщу 0,7% агаризованого середовища А-3. Відношення до джерел живлення –
- Київ+380960830922