РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об’єктами дослідження були штами мікобактерій: епізоотичні повільно- та
швидкорослі [172] M. bovis, швидкорослі атипові, виділені з молока (АТ-1) та
лімфатичних вузлів (АТ-2) великої рогатої худоби, реагуючої на ППД-туберкулін
для ссавців. Для порівняльної оцінки досліджували еталонний штам Valleе,
наданий нам на середовищі Павловського Інститутом сільськогосподарської
мікробіології, м. Чернігів, та вакцинний штам BCG.
На початку досліджень, з метою вияснення епізоотичної ситуації, провели
епізоотологічне обстеження трьох неблагополучних щодо туберкульозу господарств
Дніпропетровської області, яка розташована в степовій зоні України. Для цього
вивчали поточну та звітну документацію, зокрема, акти на проведення алергічного
обстеження тварин, провели алергічні, патолого-анатомічні з послідуючим
відбором біологічного матеріалу (65 проб) та бактеріологічні дослідження.
Виділення культур мікобактерій з біологічного матеріалу, а також їх накопичення
з послідуючим відбором зразків біомаси для вивчення біохімічного складу
(ліпідів) проводили в навчально-дослідній лабораторії кафедри епізоотології та
інфекційних хвороб Дніпропетровського держав-ного аграрного університету.
Дослідження ліпідного складу мікобактерій проводили в НДІ біології
Дніпропетровського національного університету у співпраці з кандидатом
біологічних наук Філоник І.О.
Передпосівну обробку проб патологічного матеріалу від великої рогатої худоби,
реагуючої на ППД-туберкулін для ссавців, та піддослідних тварин здійснювали за
методикою В.А. Матузенка зі співавт. [157]. Всі етапи роботи проводили
стерильно. У колбу з магнітом вносили дрібно нарізані шматочки матеріалу,
заливали у співвідношенні 1:6 штучним шлунковим соком (4 г пепсину, 1 см3
соляної кислоти на 100 см3 дистильованої води) і ферментували на магнітомішалці
протягом 3 год за температури 37 °С при 1500 об/хв. Пробу відстоювали 30–40 с
для осідання великих шматочків, надосадову рідину зливали в центрифужний стакан
та центрифугували протягом 5 хв при 5000 об/хв. Надосадову рідину видаляли, до
осаду додавали 6 %-ву сірчану кислоту (1:6), ретельно перемішували протягом 10
хв і центрифугували протягом 5 хв при 5000 об/хв. Осад двічі відмивали
стерильним ізотонічним розчином шляхом центрифугування за тих же умов і
використовували для мікроскопії після фарбуваня за методом Ціля-Нільсена, а
також для посіву на живильні середовища.
Для зараження лабораторних тварин використовували цей же осад, який попередньо
нейтралізували 10 %-вим гідрокарбонатом натрію протягом 15 хв.
Передпосівну обробку проб молока проводили за загальноприйнятою методикою
[100]: 150 см3 молока центрифугували протягом 20–30 хв при 3000 об/хв. Середній
шар вилучали, з верхнього жирового шару та осаду робили мазки, які перед
фарбуванням попередньо знежирювали ефіром протягом 20–30 хв. Потім осад
обробляли 3–6 %-вим розчином сірчаної кислоти протягом 20–30 хв, 4 %-вим
розчином гідроокису натрію протягом 10–15 хв, струшували і центрифугували 10–15
хв при 3000 об/хв. Надосадову рідину вилучали, а осад використовували для
посіву на живильне середовище.
Для виділення мікобактерій використовували яєчне живильне середовище (рН 7,1)
за складом ідентичне стандартному, виготовленому ДП „Ветеринарна медицина”, м.
Харків.
Висів з кожного зразка патологічного матеріалу проводили платиновою петлею на 6
пробірок зі скошеним живильним середовищем, які інкубували в термостаті
протягом трьох місяців за температури 37 °С, зі щоденним спостереженням.
При виявленні колоній мікроорганізмів проводили фарбування за Цілем-Нільсеном і
переглядали їх під мікроскопом Біолам Л–211.
Для вивчення видової належності мікобактерій, суспензією досліджуваного
матеріалу, кожною пробою окремо, заражали підшкірно в ділянці паху морських
свинок в дозі 1 см3. За тваринами спостерігали протягом 3-х місяців.
Сенсибілізуючі властивості досліджуваних штамів вивчали за допомогою
алергічного методу через 20, 30, 60 та 90 діб після зараження лабораторних
тварин зависю мікобактерій. У вказані строки вводили ППД-туберкулін для ссавців
у дозі 25 МО в 0,1 см3 ізотонічного розчину внутрішньошкірно із зовнішнього
боку стегна [40, 122].
Облік результатів проводили через 24 та 48 годин після введення алергену. За
позитивну вважали реакцію у разі наявності гіперемії на місці введення та
набряку діаметром 5 мм і більше.
Накопичення біомаси досліджуваних штамів проводили на наступних середовищах:
– яєчне живильне середовище для культивування мікобактерій (рН 7,1), за складом
ідентичне стандартному, виготовленому ДП „Ветеринарна медицина”, м. Харків;
– яєчне живильне середовище для культивування мікобактерій, рН 6,5;
– рідке синтетичне живильне середовище Сотона з рН 7,1 та 6,5;
– картопляно-гліцеринове середовище Павловського.
Із виділених мікобактерій готували завись в концентрації 1 мг бактеріальної
маси в 1 см3 стерильного ізотонічного розчину, яку в кількості двох платинових
петель висівали на щільне живильне середовище.
Після виділення на яєчному середовищі деякі штами мікобактерій висівали на
картопляно-гліцеринове середовище Павловського. У фазі актив-ного росту плівку
культури переносили в колби з рідким синтетичним середовищем Сотона для
подальшого культивування.
Властивості чистих культур виділених мікобактерій вивчали у першій генерації
після пересіву на живильне середовище за допомогою культурально-морфологічних
та біохімічних тестів.
Із культурально-морфологічних особливостей мікобактерій визначали:
час появи колоній після посіву зависі культури мікобактерій за
загальноприйнятою методикою. Початок росту оц
- Київ+380960830922