ГЛАВА 2
Материалы и методы исследований.
Получение эритроцитов
Эритроциты получали из свежеконсервированной крови, заготовленной на
глюгицировом консерванте (2% цитрат натрия и 3% глюкоза). Кровь у птиц (куры)
забирали из подкрыльцовой вены шприцом. Место забора предварительно
дезинфицировали 70% этанолом. Кровь забирали в стерильную пробирку (обычно в
объеме 2,0 – 3,0 мл) на глюгицировом консерванте. Образцы хранили в
холодильнике и использовали в день забора. Кровь барана получали из яремной
вены. Участок забора выстригали и дезинфицировали 70% этанолом. Кровь забирали
на глюгицировый консервант в стерильные флаконы в объеме 250-350 мл и хранили в
холодильнике при +4оС. После удаления плазмы эритромассу трижды отмывали путем
центрифугирования при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме
физиологического раствора (0,15 Моль/л хлорид натрия, 0,01 Моль/л трис-буфер,
pH 7,4). Лейкоцитарную пленку и супернатант удаляли методом аспирации. Осадок
эритромассы содержал в среднем 80 % клеток. Эритроциты в виде плотного осадка
хранили при 4 °С и использовали в течение 4 часов.
2.2. Изучение влияния алканолов и хлорпромазина на гипотонический гемолиз
эритроцитов.
Для того, чтобы оценить осмотическую устойчивость эритроцитов, аликвоту клеток
из сток раствора (гематокрит 1%) переносили в гипотоническую среду (60-75
ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Трис-НСl, 40-60 ммоль/л Na2SO4, 10 ммоль/л Трис-НСl,
70-80 ммоль/л cахароза, 10 ммоль/л Трис-НСl, рН 7,4) при комнатной температуре
(23оС). Концентрация электролита и неэлектролита подбиралась таким образом,
чтобы гемолиз в среде составлял примерно 50-60 %. Для изучения влияния
n-алканолов на развитие гипотонического гемолиза эритроцитов, в литическую
среду добавляли спирты в конечных концентрациях 54-324 ммоль/л бутанола и 1-15
ммоль/л гексанола и перемешивали до полного растворения исследуемых веществ в
среде, а затем добавляли клетки. Для изучения влияния хлорпромазина на развитие
гипотонического гемолиза эритроцитов его добавляли в литическую среду в
конечных концентрациях 7,5-150 мкмоль/л, а затем добавляли клетки.
Для регистрации динамики гемолиза эритроцитов в работе была использована
установка для измерения светорассеяния клеточных суспензий, созданная на базе
монохроматора СФ-4А. Динамика гемолиза эритроцитов была измерена
спектрофотометрическим методом на длине волны 720 нм при расходимости светового
пучка 3 градуса. В кювету с изотоническим раствором (2 мл) при постоянном
перемешивании вводили 6-10 мкл суспензии клеток (время перемешивания 2 с).
Уровень гипотонического гемолиза рассчитывали по формуле: Гипотонический
гемолиз= (1-А/А0)100%, где А0 – оптическая плотность контрольного образца.,
соответствующая 0% гемолиза, А – оптическая плотность исследуемого образца.Для
оценки эффективности действия хлорпромазина при добавлении его после начала
гемолитического процесса был введен коэффициент ингибирования который
рассчитывался по формуле К = (1 - А2/А1) 100%, где. А2 – изменение оптической
плотности после введения хлорпромазина, А1 – изменение оптической плотности за
тот же промежуток времени без хлорпромазина. Скорость гемолиза измеряли как
тангенс угла наклона касательной к кривой гемолиза и нормировали на скорость
гемолиза контрольного образца.
2.3 Исследование скорости транспорта Н+ методом рН-метрии.
Эритроциты барана и курицы отмывали трижды безбуферным раствором 0,15 моль/л
NaCl по стандартной методике.
При анализе эритроцитов методом рН-метрии в термостатируемую ячейку помещали по
2 мл раствора 0,12 мМоль/л сульфата натрия (37 ?С), доводили рН раствором
гидроокиси натрия до уровня внутриклеточного рН (6,9-7,6), после чего в ячейку
вносили по 50 мкл эритромассы с конечным 2% гематокритом и производили
измерение изменения рН. Для изучения влияния спиртов в ячейку перед
эритроцитами вносили алканолы в различных концентрациях. (n-бутанол: 0-342
ммоль/л или n-гексанол: 0-15 ммоль/л) и проводили измерение изменения рН в их
присутствии. Запись изменений рН суспензии эритроцитов производили с помощью
рН-электрода на самописце Эндим (ГДР).
Обмен внутриклеточного хлорида на внеклеточный сульфат в незабуференной среде
сопровождается последовательно фазой закисления и фазой защелачивания суспензии
эритроцитов.[105]. Транспорт протонов из клетки и в клетку можно представить
реакциями первого порядка:
; . (2.1)
В данном случае кинетика процесса описывается системой уравнений:
(2.2)
Разделение переменных и интегрирование уравнений (2.3) при начальных условиях:
t=0, , даёт:
(2.3)
Подстановка уравнений (2.3) в (2.2) приводит систему (2.2) к виду:
(2.4)
Показано, что количество протонов, транспортируемое из клетки, в данных
экспериментальных условиях равно количеству протонов, поступившего в клетку
[105]. Следовательно, . С учётом этого, комбинирование системы уравнений
(2.4):
. (2.5)
Интегрирование приводит уравнение (2.6) к виду:
(2.6)
Экспериментальная двухфазная рН кривая имеет максимум в момент времени tмакс,
определяемый уравнением (2.5):
, (2.7)
откуда
. (2.8)
Соответственно, максимальная концентрация протонов
. (2.9)
Используя экспериментальные параметры tмакс, , с помощью численного решения
системы уравнений (2.8) и (2.9) можно рассчитать константы и . Перенос протонов
через мембрану эритроцитов определяется по сдвигу значения рН во внеклеточной
среде, поэтому ; , где
- Київ+380960830922