РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИКИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1 Експериментальна частина
Експериментальні дослідження виконані на базі відділу патоморфології з експериментально-біологічним відділенням Київського інституту ортопедії АМН України (керівник - проф. А.Т. Бруско).
Метою дослідження було вивчити дозозалежний вплив антигомотоксичного препарату Цель-Т та глюкокортикоїдного препарату флостерон на перебіг репаративних процесів та розвиток післятравматичного остеоартрозу при трансхондріальному пошкодженні колінного суглоба.
Робота виконана на 145 дорослих щурах-самцях лінії Вістар, масою 250±5 г. У всіх тварин під ефірним наркозом в умовах операційної парапателярно розтинали суглобову капсулу правого колінного суглоба та скальпелем в сагітальній площині по надколінковій поверхні стегнової кістки наносили з використанням шаблону, стандартне, трансхондріальне пошкодження суглобового хряща, довжиною 5 та глибиною 1,5 мм. Після цього рану суглобової капсули зашивали. Поставлено 8 серій дослідів.
Тварини всіх серій до початку дослідження знаходились в умовах віварію на звичайному харчовому раціоні. Утримання та харчування тварин здійснювали відповідно з "Санітарними правилами створення, обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)" від 06.04.1973 р. та доповнень від 04.12.1978 р. до Наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.1966 р. "Про добові норми харчування тварин та продуценти". У період акліматизації (два тижні) і під час експерименту тварини знаходились у віварії при температурі 18-22 оС, вологості 50-60 %, природному світловому режимі "день - ніч". Підбір тварин та формування груп проводили за методом випадкових чисел.
Тварини першої серії (25 щурів) служили контролем для тварин другої - восьмої серій дослідів. Тваринам першої серії з першого дня після зашивання суглобової рани в порожнину оперованого колінного суглоба вводили по 0,1 мл сольового фізіологічного розчину з інтервалом між введеннями три доби.
Тваринам другої серії (25 щурів) вводили одноразово, третьої (20 щурів) - триразово, четвертої (15 щурів) - шестиразово та п'ятої серій (15 щурів) - десятиразово по 0,1 мл препарату Цель-Т за такою самою схемою, як і тваринам першої серії.
Щурам шостої - восьмої серій експериментів вводили в оперований колінний суглоб препарат флостерон у кількості 0,025 мг: шоста (20 тварин) - одноразово, сьома (15 тварин) - дворазово та восьма (10 тварин) - триразово з інтервалом між ін'єкціями два тижні.
Прооперованих щурів утримували в умовах віварію згідно загальноприйнятих вимог до утримання лабораторних тварин.
За всіма тваринами проводили клінічне спостереження. Із досліду щурів виводили шляхом застосування летальних доз ефіру для наркозу в строки 7, 14, 30, 90 та 180 діб після оперативного отримання трансхондріального пошкодження надколінкової поверхні стегнової кістки (таблиця 2.1). На кожний строк спостереження в усіх серіях дослідів взято по п'ять тварин.
Для морфологічного дослідження брали колінний суглоб. Після фіксації в 10% розчині формаліну проводили декальцинацію препаратів у 8% розчині азотної кислоти, зневоднювали та знежирювали в ацетонах і спиртах наростаючої міцності. Шматочки заливали в целоїдин та отримували в горизонтальній площині гістологічні зрізи, які фарбували гематоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за ван Гізон. Осередки проліферації хондроцитів підраховували використовуючи МБС-2. Для вимірювання гістологічних структур за Автанділовим [1] застосовували окуляр-мікрометр.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин за серіями та строками спостереження
Серії тваринКількість тварин за строками спостереження, дібВсього7143090180Перша (контрольна для всіх серій)5555525Друга5555525Третя-555520Четверта--55515П'ята--55515Шоста-555520Сьома--55515Восьма---5510Всього1020354040145 Вираженість дегенеративно-дистрофічного процесу в колінному суглобі оцінювали за якістю та поширеністю проявлення патологічних змін структури з боку суглобового хряща. За основу взята модифікована нами схема оцінки, яка запропонована методичними рекомендаціями по експериментальному дослідженню та клінічному вивченню протиартрозних (хондромоделюючих) лікарських засобів, затверджених Фармкомітетом МОЗ України [9], та Yoshioka M. et al. [19], а саме:
А - зміна форми та зменшення кількості хондроцитів суглобового хряща (дистрофія, некроз);
Б - вогнищева проліферація хондроцитів;
В - дезорганізація, ерозія, розволокнення та поява тріщин у суглобовому хрящі;
Г - оголення підхрящової кісткової пластинки та зміни з боку субхондріальної кістки.
Д - розповсюдженість патологічних змін з боку суглобового хряща.
Нами запропонована чотирибальна система оцінки ступеня ураження, у основу якої покладено розповсюдженість відносно місця травми (мм) та тяжкість проявлення (+, ++, +++, ++++) визначених критеріїв патологічних змін з боку суглобового хряща медіально та латерально від нанесеного пошкодження: I ступінь - розповсюдженість обмежена краями пошкодження (до 0,5 мм) та тяжкість проявлення +, II ступінь - від 0,6 до 1 мм та тяжкість проявлення ++, III ступінь - розповсюдженість від 1 до 2 мм та тяжкість проявлення +++ і IV ступінь - розповсюдженість патологічних змін понад 2 мм та тяжкість їх прояву ++++ (таблиця 2.2).
Таблиця 2.2
Морфологічні критерії оцінки впливу препарату Цель-Т та флостерону на розвиток післятравматичного остеоартрозу
Морфологічні критеріїСтупінь проявів, бали1234А - зміна форми та зменшення кількості хондроцитів суглобового хряща (дистрофія, некроз)Є, немає (?)Проявля-
ється чітко (++)Виражена помірно (+++)Виражена сильно (++++)Б - вогнища проліферації хондроцитів2 - 3 малих або 1 - 2 середніх (+)3 - 4 малих,
3 - 4 середніх або 1 - 2 великих (++)5 та ? малих,
4 - 5 середніх або 3 - 4 великих (+++)6 та ? малих,
5 - 6 середніх або ? 4 великих (++++)В -