РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дисертаційна робота виконана на сучасному науково-методичному рівні з використанням сучасних методів діагностики (ПЛР) та вивчення стану імунної системи з використанням моноклональних антитіл та ІФА для визначення продукції цитокінів, імунофлуоресцентного методу для дослідження експресії рецепторів.
2.1. Загальна характеристика хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз
Вивчалась продукція цитокінів (г-ІФ, ІЛ-4, -10, ТФР-в), оксиду азоту, експресія рецепторів до гама-ІФ, ICAM, про- (CD95), анти-апоптотичні (bcl-2) маркери у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз, які обстежувались та лікувались в Інститутах урології (директор - академік АМН і НАН України, д.мед.н., професор О.Ф.Возіанов) та нефрології (директор - д.мед.н., професор М.О.Колесник) АМН України.
Мікробіологічні дослідження для діагностики хламідійної інфекції були проведені в лабораторії мікробіології, вірусології та мікології Інститутів урології та нефрології АМН України (зав. лаб. д.б.н., професор А.В.Руденко).
Досліджувались зразки різного патологічного матеріалу - зішкряби із слизової уретри, цервікального каналу, піхви, а також секрет передміхурової залози, еякулят і сеча пацієнтів, які звернулися з приводу запальних захворювань сечостатевої системи.
Відомо, що мікробіологічна діагностика при підозрі на хламідійну інфекцію здійснюється в двох основних напрямках:
* Виявлення в досліджувальному матеріалі збудника, його антигенів або специфічних фрагментів ДНК;
* Виявлення специфічних сироваткових імуноглобулінів, обумовлених персистенцією Ch.trachomatis.
Для комплексної діагностики хламідіозу проведене мікроскопічне дослідження біологічного матеріалу, використовувався метод прямої імунофлуоресценції (ПІФ), серологічні дослідження (ІФА).
При використанні бактеріоскопічного методу при світловій мікроскопії у пофарбованому по Романовському-Гімзе препараті виявляли тільця хламідій. Елементарні тільця - невеликі утворення округлої форми (0,15 - 0,3 мкм), пофарбовані в рожевий або червоний колір, розташовані переважно позаклітинно. Ретикулярні тільця - більші утворення (0,5 -1,5 мкм).
В основі методів імунологічної діагностики лежить взаємодія специфічних моноклональних антитіл з ліпополісахаридним антигеном хламідій. В біологічному матеріалі виявляється родоспецифічний антиген хламідій реакцією прямої імунофлуоресценції (ПІФ), імуноферментним аналізом (ІФА). Пряма ідентифікація хламідій флуоресцийованими моноклональними антитілами (ПІФ) проти основного білка зовнішньої мембрани та ліпополісахаридів (ЛПС) C. trachomatis дозволяє виявити як включення хламідій внутрішньоклітинно, так і одиничні позаклітинні елементарні тільця.
В реакції імуноферментного аналізу досліджували сироватку крові на наявність антитіл класу IgA, IgM, IgG до антигенів C.trachomatis диагностичною імуноферментною тест-системою "Хлами-Бест C.trachomatis", яка являє собою набір, головним реагентом якого є очищений білковий антиген Ch.trachomatis. Діагностичні титри для IgA - 1:100, IgM - 1:100, IgG - вище 1:100. Для діагностики використовували також тест системи "Вектор Бест" (Росія), Calbiotest (США), Equipar (Італія).
При використанні методу ПЦР для діагностики урогенітального хламідіозу паралельно досліджували епітеліальні зішкряби уретри, цервікального каналу, секрету передміхурової залози і еякулят на наявність в них ДНК Ch.trachomatis методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням видоспецифічних праймерів Ch.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum, G.vaginalis (реактиви та обладнання виробництва фірми "ДНК-Технология", Москва, Росія).
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) основана на тому, що в досліджуваний зразок матеріалу вносять синтезовані нуклеотидні послідовності - праймери, які можуть комплементарно взаємодіяти з геномною ДНК або РНК інфекційного агенту. Попередньо ідентифікований матеріал обробляють термічно. Це призводить до денатурації двохспіральної ДНК, яка стає доступною для взаємодії з двома праймерами, комплементарними визначеній зоні геному. Здійснюючи повторні цикли денатурації і ренатурації, створюємо умови для розмноження (ампліфікації) частини ДНК до визначеної кількості, достатньої для виявлення.
Дослідження стандартних показників імунітету проводили у 160 хворих (в порівнянні з 180 здоровими); цитокін-продукуючої активності імунокомпетентних клітин - у 105 хворих (з них 75 з підтвердженим за допомогою вищезгаданих методик діагнозом "хронічний сечостатевий хламідіоз"); контрольну групу складали 30 здорових жителів Києва. Серед пацієнтів з хламідіозом було 40 чоловіків та 35 жінок. Вік хворих - від 19 до 38 років, в основному- 25-30 років (табл. 2.1). При порівнянні груп з використанням критерію хі-квадрат групи не відрізнялись за ознаками статі (р=0,248) та віку (р=0,731).
Таблиця 2.1
Розподіл хворих на ХССХ, у яких вивчений стан цитокін-продукуючої активності імунної системи, та контрольної групи здорових донорів за віком
ВікКількістьХворі на хламідіоз Здорові донориабс. кількість%абс. кількість%18-252533%1525%Продовження таблиці 2.126-303040%2745%31-351217%1220%? 35810%610%Всього75100%60100%
Клінічно майже всі пацієнти з підтвердженим діагнозом "хламідіоз" скаржились на слабкість, швидку стомлюваність; 40% - на болі внизу живота; 60% - на болі, різі при сечовипусканні; 50% - на виділення слизу із уретри.
20% пациієнтів звернулись за медичною допомогою з приводу урогенітального хламідіозу вперше, 80% хворих лікувались з приводу даного захворювання раніше, попередні методи лікування були неефективні. В анамнезі жінки в більшості випадків були на спостереженні декілька років у гінеколога з приводу хронічних запальних захворювань, 25% із них лікувались з приводу безпліддя. У чоловіків зареєстровано 10% випадків безплідних шлюбів, більшість були на спостереженні у уролога протягом останніх років.