РОЗДІЛ 2. ФІТОХІМІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ СПОЛУК ТРАВИ ГРІНДЕЛІЇ РОЗЧЕПІРЕНОЇ
Першим етапом нашого дослідження було попереднє фітохімічне вивчення трави грінделії розчепіреної на вміст різних класів біологічно активних сполук. Наявність цих сполук встановлювали за допомогою загальноприйнятих хімічних реакцій ідентифікації та методів хроматографічного аналізу.
Траву грінделії розчепіреної досліджували на вміст амінокислот [29, 77, 107, 113], флавоноїдів [16-18, 50, 56, 107, 108], кумаринів [16-18, 36, 44, 68, 82, 108], гідроксикоричних кислот [2, 16, 63, 69, 107,108], вуглеводів [29, 107, 111], вільних органічних кислот [2, 57, 113 128], стероїдів [16-18, 111], аскорбінової кислоти [111, 113], дубильних речовин [27, 111, 113], сапонінів [92, 111], мікроелементів та макроелементів [66, 77, 110].
Для проведення якісного аналізу використовували траву грінделії розчепіреної, заготовлену в Харківській області, з якої готували водні та спирто - водні екстракти.
2.1. Отримання екстрактів для проведення якісних реакцій на деякі групи природних сполук
Одержання водних екстрактів. 50,0 г сухої трави грінделії розчепіреної, подрібненої до розміру частинок 1-2 мм, вміщували в колбу зі шліфом, заливали 200 мл води та нагрівали на киплячому водяному нагрівнику зі зворотним холодильником протягом 30 хвилин. Отриманий витяг фільтрували через складчастий фільтр в суху колбу. Екстракцію сировини проводили ще два рази новими порціями розчинника. Об'єднані витяги концентрували в вакуумі та використовували для визначення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин.
Одержання спирто - водних екстрактів. Для цього брали по 50,0 г трави грінделії та екстрагували 50% етанолом згідно вищеописаної методики.
Об`єднаний витяг концентрували у вакуумі до 100 мл. 50 мл отриманого витягу залишали для дослідження, а другу частину випарювали у вакуумі до водного залишку, утворений осад ліпофільних речовин відфільтровували. Фільтрат обробляли у ділильній воронці 8 разів хлороформом порціями по 40 мл.
Після обробки водний залишок нагрівали на киплячій водяній бані до видалення слідів хлороформу, охолоджували і послідовно екстрагували етилацетатом і н-бутанолом. Об'єднані хлороформні, етилацетатні та н-бутанольні фракції, а також водний залишок концентрували у вакуумі.
Таким чином, для проведення якісних реакцій з трави грінделії розчепіреної отримали хлороформні, етилацетатні, бутанольні фракції та водний залишок, у яких виявляли амінокислоти, фенольні сполуки та інші.
2.2. Якісне дослідження біологічно активних сполук грінделії розчепіреної
2.2.1. Амінокислоти
Амінокислоти виявляли методом паперової хроматографії водних екстрактів та водних залишків, отриманих з трави грінделії розчепіреної, трикратною розгонкою в системі розчинників: н-бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2).
Хроматограми після хроматографування висушували, обробляли 0,2% розчином нингідрину в етанолі та нагрівали в сушильній шафі протягом декількох хвилин при 80-1000С.
Поява рожевих, рожево-фіолетових і фіолетових плям свідчила про наявність амінокислот у траві грінделії розчепіреної [113].
Як свідки при хроматографуванні використовували: D-L-треонін, L-аспарагін, L-цистеїн, D-L-норлейцин, D-L-метіонін, D-L-аспарагінову кислоту, D-L-феніл-?-аланін, L-гістидину хлорид, D-L- лейцин, D-L-валін, D-L-лізину хлорид і інші зразки амінокислот.
Як видно зі схеми хроматограми, яка представлена на рис. 2.1, в результаті дослідження з вірогідними зразками було ідентифіковано 9 амінокислот: треонін, аспарагін, цистеїн, норлейцин, метіонін, фенілаланін, гістидин, валін та лізін.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
А В
Рис. 2.1 Схема паперової хроматограми амінокислотного аналізу, де
А - водний екстракт трави грінделії розчепіреної;
В - суміш достовірних зразків амінокислот: 1 - лізин, 2 - гистидін, 3 - аспарагін, 4 - фенілаланін, 5 - треонін, 6 - норлейцин, 8 - валін,
9 - метіонін, 10 - цистеїн.
Система розчинників: н-бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2)
2.2.2. Вільні органічні кислоти
Вивчення вільних органічних кислот грінделії розчепіреної проводили методом паперової хроматографії і хроматографії в тонкому шарі сорбенту. Для дослідження використовували водні витяги та водні залишки.
Дослідження проводили в системах розчинників: етанол - хлороформ - розчин аміаку концентрований - вода (70:40:20:2), н-бутанол - мурашина кислота - вода (30:5:10) та бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:2). Як вірогідні свідки використовували яблучну, лимонну, саліцилову, бензойну, винну, янтарну і щавлеву кислоти (рис. 2.2 та рис. 2.3).
1 2 А 3 4 5 А
Рис. 2.2 Схема ТШХ хроматограми вивчення вільних органічних кислот, де: А - аналізований екстракт, 1- яблучна кислота,
2 - саліцилова кислота, 3- винна кислота, 4 - янтарна кислота, 5- щавлева кислота.
Система розчинників: н-бутанол - мурашина кислота - вода (30:5:10)
Хроматограми після хроматографування добре висушували й обробляли 0,1%-ним розчином 2,6-дихлорфеноліндофенола у 95%-ному етанолі і нагрівали у сушильній шафі.
Після короткочас