РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень та умови проведення експериментів
Експериментальні дослідження виконані на 280 статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г. Позаяк показники імунної системи змінюються залежно від пори року, дослідження проводили в осінньо-зимовий період. Експериментальні втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових досліджень (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (протокол № 8 від 15.12.2004р.) порушень вимог не виявлено. Модель хронічного гіперімунокомплексного синдрому створювали за допомогою класичної моделі C. Cohrane та D.Kofler у модифікації R. Williams [139, 328] та посилаючись на праці попередніх досліджень Чоп'як В.В. [40, 98].
Усі експериментальні тварини були поділені на 4 серії:
І серія - інтактні тварини, яким вводили внутрішньоочеревинно фізіологічний розчин (40 тварин);
ІІ серія - інтактні тварини, яким вводили корвітин внутрішньоочеревинно в дозі 40 мг/кг маси тіла щура впродовж 10 днів (40 тварин);
ІІІ серія - тварини з викликаним хронічним гіперімунокомплексним синдромом, яким у хвостову вену кожні 7 днів впродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін із розрахунку 100мг/кг впродовж 12 тижнів (40 тварин).
IV серія - тварини з викликаним хронічним гіперімунокомплексним синдромом, яким вводили внутрішньоочеревинно корвітин у дозі 40 мг/кг маси тіла щура впродовж 10 днів (40 тварин);
При доборі дози препарату керувались літературними даними [48].
Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації. Черевну аорту відпрепаровували, очищали від жирових наростів, промивали в охолодженому фізіологічному розчині та використовували для виділення ендотеліоцитів.
Кров для виділення нейтрофільних гранулоцитів забирали на гепарині (50 од.мл). Отримання клітин нейтрофілів проводили із застосуванням розчинів фікол-урографіну з густиною 1,077 г/мл та 1,095 г/мл. Виділені клітини використовували для проведення відповідних досліджень.
Для отримання сироватки крові периферичну кров витримували впродовж 1 год. в термостаті при температурі 370С та 1 год. при температурі +40С. Сироватку крові відбрирали після центрифугування крові при 1500 об/хв. 10 хв.
Дослідження in vitro проводилось на 120 білих щурах у 8 серіях клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів:
І серія - нейтрофіли інтактних тварин, інкубовані без ендотеліоцитів (сумарно 20 тварин);
ІІ серія - ендотеліоцити інтактних тварин, інкубовані без нейтрофілів (сумарно 20 тварин);
ІІІ серія - сумісна інкубація нейтрофілів та ендотеліоцитів інтактних тварин (сумарно 20 тварин);
IV серія - сумісна інкубація нейтрофілів та ендотеліоцитів інтактних тварин у присутності корвітину (сумарно 20 тварин);
V серія - нейтрофіли тварин із змодельованим ХГІС, інкубовані без ендотелію (сумарно 20 тварин);
VІ серія - ендотеліоцити тварин із змодельованим ХГІС, інкубовані без нейтрофілів (сумарно 20 тварин);
VІІ серія - сумісна інкубація нейтрофілів та ендотеліоцитів тварин із змодельованим ХГІС (сумарно 20 тварин);
VІІІ серія - сумісна інкубація нейтрофілів та ендотеліоцитів тварин із змодельованим ХГІС в присутності корвітину (сумарно 20 тварин);
В експериментах in vitro використовували нейтрофіли периферичної крові щурів та ендотеліоцити черевної аорти. Отримані нейтрофіли відмивали фізіологічним розчином і ресуспендували до робочих концентрацій (3*106/мл) у 199 середовищі із 10% вмістом телячої ембріональної сироватки. Підраховували клітини в камері Горяєва. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою 0,1% трипанового синього [30]. Виділені ендотеліоцити відмивали 199 середовищем і доводили до концентрації 3*106 в 1 мл у повному поживному середовищі. Підраховували клітини в камері Горяєва. Інкубацію клітин проводили в 24 лункових пластикових планшетах ("Sigma") з використанням вставок із напівпроникними мембранами з діаметром пор 3?м ("Sigma") для запобігання змішування клітин нейтрофілів та ендотеліоцитів. У кожну лунку планшети вносили по 200 мкл суспензії ендотеліоцитів (3*106/мл) та нейтрофілів у співвідношенні 1:1[48]. Клітини інкубували в термостаті при 370С в атмосфері з 5% СО2 впродовж 1 год. При таких співвідношеннях і в умовах інкубування культура різних популяцій фагоцитів є адекватною моделлю для вивчення кооперативної взаємодії між цими клітинами, коли їх життєздатність коливається від 83 до 96% [1]. В умовах in vitro ендотеліальні клітини зберігають більшість властивостей, насамперед - здатність синтезувати та виділяти притаманні їм біологічно активні речовини. Попри деякі особливості (наприклад, ізоляцію ендотеліоцитів від клітин інших типів, нервових і гуморальних впливів), метод культивування є адекватним для вивчення морфофункціональних властивостей ендотеліальнних клітин, а також дослідження дії на ці клітини біологічно активних сполук, у тому числі різних фармакологічних препаратів [34]. Після інкубації клітини відбирали і використовували для подальших досліджень.
Для визначення впливу корвітину на функціональну активність нейтрофілів та ендотеліоцитів інтактних тварин та тварин із змодельованою ХГІС у лунку планшети вносили по 200 мкл розчину корвітину в дозі 1*10-4 г/л. Досліджено, що при застосуванні корвітину в такій концентрації в умовах in vitro спостерігався максимально виражений нормалізуючий вплив на функціональну активність популяцій фагоцитів [32, 48].
Препарат Корвітин розроблений в Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика та Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця і люб'язно наданий академіком Мойбенком О.О.
Окрім цього, для дослідження використовували нейтрофіли і сироватку крові 90 хворих (чоловіків - 2