РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Постановка эксперимента
При выполнении настоящей работы использовали самцов крыс линии Вистар 3-, 24- и 27-28- месячного возраста массой 180-250 и 350-450 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Все исследования на животных проводили с соблюдением Международных принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1985). Объектом исследования служили: печень, изолированные гепатоциты, желчь и сыворотка крови крыс. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента:
1. Интактные животные 3-, 24- и 27-28-месячного возраста, из печени которых выделяли гепатоциты и получали гомогенат ткани при изучении возрастных особенностей модуляции содержания и обмена липидов флавоноидами.
2. При изучении влияния камилофлана на содержание липидов в печени крыс использовали животных 3-, 24- и 27-28- месячного возраста, которым в течение 6 дней (2 раза в день) внутрижелудочно вводили камилофлан в дозе 80 мг/кг, растворенный в 1 % водном растворе этанола, в объеме 5 мл/кг. Контролем служили животные, которым в течение 6 дней внутрижелудочно вводили растворитель в эквивалентном объеме.
3. При изучении возрастных особенностей внешнесекреторной функции печени и влияния камилофлана на желчеотделение крыс разного возраста использовали животных 3- и 24- месячного возраста, которым однократно интрадуоденально вводили камилофлан, растворенный в 1 % водном растворе этанола, в дозах 20, 40 и 80 мг/кг массы тела (1 мл/кг), и в течение 4 часов собирали желчь. Контролем служили животные, которым однократно интрадуоденально вводили растворитель в эквивалентном объеме.
4. При моделировании стеатоза, индуцированного ССl4, и его коррекции флавоноидами животным в течение 4 дней подряд подкожно вводили ССl4 в дозе 4 мл/кг в виде 50 % раствора в кукурузном масле, а внутрижелудочно - 6 дней подряд (два раза в день) - 1 % - ный водный раствор этанола в объеме 5 мл/кг, или флавоноиды - камилофлан, фламин и силибор - в дозе 80 мг/кг, растворенные в 1 % - ном водном растворе этанола, в объеме 5 мл/кг. Контролем служили животные, которым вводили растворители в эквивалентных объемах.
5. С целью изучения влияния флавоноидов на функциональное состояние и гистоструктуру ткани печени в условиях хронического стеатоза, использовали модель хронического токсического поражения печени ССl4. Гепатотоксин вводили животным подкожно 2 раза в неделю в течение 8 недель в дозе 4 мл/кг в виде 50 % раствора в кукурузном масле. Внутрижелудочно 2 раза в день в течение 8 недель вводили 1 % - ный водный раствор этанола (5 мл/кг), или или флавоноиды - камилофлан, фламин и силибор - в дозе 80 мг/кг, растворенные в 1 % - ном водном растворе этанола (5 мл/кг). Контролем служили животные, которым вводили растворители в эквивалентных объемах.
2.2. Эксперименты на печени и гомогенате печени
Печень животного, наркотизированного диэтиловым эфиром, перфузировали in situ охлажденным до t +4?С изотоническим раствором NaCl, извлекали из брюшной полости и продавливали через перфорированную пластину с диаметром пор 0,3 мм при t +4°С. Для определения содержания липидов в печени 1 г ткани растирали в гомогенизаторе с 3 мл dist. Н2О при t +4°С и использовали для последующей экстракции липидов. В экспериментах по изучению влияния флавоноидов на метаболизм сфинголипидов в печени суспензию ткани готовили с использованием 3 мл буфера, как описано в п. 2.18.
2.3. Эксперименты на изолированных гепатоцитах
Нативность клеточных мембран гепатоцитов, выделенных неферментативным методом [196], оценивали с помощью 0,4 % раствора трипанового синего и определения активности ЛДГ в среде инкубации. Выход жизнеспособных клеток составлял 90?5 %. Гепатоциты ресуспендировали (до концентрации 6·106 клеток в 1 мл) в среде Игла (рН 7,4), содержащей 25 мМ HЕРЕS, пенициллин (61 мг/л), стрептомицин (100 мг/л) и 10% эмбриональную сыворотку быка. Клетки инкубировали при t +37оС с флавоноидами (камилофлан - 250, 500 и 750 мкг/мл, АП-7-ГЛ - 10, 30 и 60 мкM/л), растворенными в этаноле (конечная концентрация в растворе - 30 мM/л), или с этанолом (30 мM/л) в течение 4 или 24 часов, или с CСl4 (7, 10, 20, 40 и 100 мM/л) в течение 2 часов. В отдельных случаях CСl4 (40 мM/л) добавляли к гепатоцитам, инкубированным в течение 2-х часов с растворителем или флавоноидами, и инкубировали еще 2 часа. После окончания инкубации определяли количество и жизнеспособность гепатоцитов (тест с трипановым синим, активность ЛДГ в среде инкубации). Пробы центрифугировали (5 мин·(3000 об/мин)), клетки лизировали, используя dist. Н2О, и проводили экстракцию липидов как описано в п. 2.4.
2.4. Экстракция липидов
Липиды из гомогената печени (приготовленного на dist Н2О, 50 мM ацетатном буфере (рН 5,0), или 50 мM трис-HCl-буфере (рН 7,35) с добавлением 1 мM ЭДТА) и изолированных гепатоцитов экстрагировали по методу Bligh, Dyer [197] в смеси хлороформ: метанол (1: 2, по объему), встряхивая. Полученный экстракт центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу отбирали, ткань дополнительно экстрагировали в избытке смеси хлороформ: метанол: Н2О (1:2: 0,8, по объему) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатанты объединяли и приливали хлороформ и Н2О. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу отбрасывали, а нижнюю выпаривали под вакуумом при температуре +37оС. Сухой осадок растворяли в смеси хлороформ: метанол (2:1, по объему) и использовали для тонкослойной хроматографии.
2.5. Разделение липидов с помощью тонкослойной хроматографии
Липиды разделяли на фракции в тонком слое силикагеля Wоеlm в восходящем токе растворителей. ДАГ, ХС, ЖК, ТГ и общие ФЛ разделяли в системе растворителей: гексан: диэтиловый эфир: СН3СООН (73:25:2, по объему). Для разделения СФЛ использов