ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Организация экспериментальных исследований
Для выявления реакции гуморальных систем организма на действие ионизирующего излучения и поиска способов коррекции возникающих повреждений, проведены экспериментальные исследования на 116 белых лабораторных крысах-самцах линии "Вистар" массой 180-210 г. Содержание животных в виварии было одинаковым, что является необходимым условием создания структурной группы [124, 133]. Эксперименты проводились с соблюдением принципов "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 1986) и постановления Первого национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001) [154]. Комиссией по вопросам биоэтики Крымского государственного медицинского университета имени С.И. Георгиевского (протокол № 2 от 25 октября 2006 года) нарушений морально-этических норм при проведении научно-исследовательской работы не выявлено.
Для проведения экспериментального исследования лабораторные животные были разделены на 4 группы:
1 - контрольная группа животных, находившихся в обычных условиях вивария - 32 особи;
2 - животные, подвергавшиеся однократному тотальному действию ионизирующего излучения в дозе 6 Гр с последующей декапитацией через 24 часа, 3, 7, 14 и 30 дней после воздействия, соответственно - 60 особей.
3 - животные, которые подвергались изолированному воздействию ЭМИ КВЧ в течение 9 дней по 30 мин ежедневно - 12 особей.
4 - группа животных, подвергавшаяся последовательному действию ЭМИ КВЧ в течение 9 дней по 30 мин ежедневно и ионизирующего излучения. Забой животных путем декапитации проводили через 3 дня после действия гамма-излучения - 12 особей.
2.2. Материал исследования
Материалом исследования служили сыворотка крови, бронхоальвеолярный смыв, супернатанты гомогенатов тканей тонкого отдела кишечника и больших полушарий головного мозга крыс.
Кровь для исследований у крыс получали путем декапитации под легким эфирным наркозом. Ранее проведенные исследования показали, что легкий эфирный наркоз не влияет на биохимические показатели сыворотки крови и бронхоальвеолярного смыва [68]. Сыворотку крови получали из нестабилизированной крови путем центрифугирования в течение 15 мин при 3 000 об/мин [30].
Для получения бронхоальвеолярного смыва после забора крови животным вскрывали грудную клетку, препарировали трахею, пересекали ее и вводили в нее катетер, который плотно фиксировали при помощи мягкого зажима. Затем выделяли легочно-сердечный комплекс и производили бронхоальвеолярный смыв (БАС) путем 6-ти кратного промывания легких 10 мл физиологического раствора нагретого до 37оС. После промывания получали 7-8 мл бронхоальвеолярного смыва. Далее его центрифугировали 15 мин при 8 000 об/мин и отбирали супернатант, который использовали для проведения биохимических исследований [68].
Гомогенаты тканей слизистой оболочки тонкого отдела кишечника и больших полушарий головного мозга получали по методике, описанной В.А. Барабой и соавторами [149]. Из тканей мозга готовили 10 % гомогенаты, используя 0,05 М трис-НСl буфер, рН 7,4. Навеску тканей измельчали и гомогенезировали в механическом гомогенизаторе в течение 5 мин. Участок тонкого отдела кишечника промывали тем же буфером, механически отделяли слизистую оболочку, из которой готовили 2,5 % гомогенат с использованием 0,05 М трис-НСl буфера, рН 7,4 и механического гомогенизатора. Все манипуляции проводили при температуре 4оС. Затем гомогенаты фильтровали через шестислойную марлю и центрифугировали 15 минут при 8 000 об/мин. Полученные супернатанты использовали для дальнейших исследований.
2.3. Методы исследования
2.3.1. Экспериментальное воздействие гамма-излучения. Экспериментальное действие ионизирующего излучения осуществляли путем воздействия на животных однократного тотального облучения с использованием гамма-терапевтического аппарата "АГАТ-Р1" (60Со) на базе отделения радиологии КРУ "КБ им. Н.А. Семашко" при следующих условиях: очаговая доза 6 Гр, поле 24х24 см, РИК=90 см, глубина=3 см (89,6 %), Р=1,155 сГр/с, длительность экспозиции 580 с. Во время облучения животные находились в изготовленных клетках-фиксаторах из органического стекла с отверстиями для свободного поступления воздуха [157, 158]. После окончания воздействия ионизирующего излучения и до конца экспериментального исследования животные находились в условиях вивария.
2.3.2. Экспериментальное воздействие ЭМИ КВЧ. Воздействие низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ проводили с помощью терапевтического генератора "КВЧ. РАМЕД-ЭКСПЕРТ - 01" с длиной волны 7,1 мм (частота излучения - 42,3 ГГц) и плотностью потока мощности 0,1 мВт/см2, изготовленного Центром радиофизических методов диагностики и терапии "РАМЕД" Института технической механики НАНУ, г. Днепропетровск (регистрационное свидетельство № 783/99 от 14.07.99, выданное КНМТ МОЗ Украины о праве на применение в медицинской практике в Украине). Воздействие осуществлялось по 30 мин на затылочно-воротниковую область в течение 9 дней. Данный режим был выбран в связи с имеющимися литературными данными [110, 138], которые свидетельствуют, что наиболее выраженный эффект действия ЭМИ КВЧ зарегистрирован при использовании данных условий.
Облучаемых животных фиксировали в прозрачной камере из оргстекла, состоящей из 5 ячеек. Размеры каждой ячейки составили 140х60 мм. Стенки и дно каждой ячейки снабжены специальными отверстиями, обеспечивающими вентиляцию и выведение отходов животных. Точечный излучатель подводили к затылочно-воротниковой области воздействия через отверстие, соответствующее размеру "точки" [137].
2.3.3. Определение трипсиноподобной активности. Принцип метода основан на измерении скорости отщепления N-?-бензоил-L-аргинина (БА) от синтетического субстрата этилового эфира N-?-бензоил-L-аргинина (БАЭЭ) (Reanal) [18, 67].
При определении трипсиноподобной активности по методике А.В. Крин