РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1 Експериментальні клітинні лінії
2.1.1 Клітинні лінії, умови культивування та отримання резистентних варіантів
Об'єктами дослідження були клітинна лінія раку яєчника людини А2780 та її аналоги, резистентні до цитотоксичної дії ППП цисплатину А2780/DDP та доксорубіцину А2780/Dох.
Клітини вихідної лінії А2780 культивували у культуральному модифікованому середовищі Dulbecco ISCOV (Sigma, Germany) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки ("Сангва", Україна) при температурі 37оС та насиченні повітря 5% СО2. Клітини пересівали двічі на тиждень з щільністю посіву 2-4x104 клітин на см2 поверхні. Пересів клітин робили, коли 50% поверхні було зайнято клітинами.
З клітинної лінії А2780 були одержані резистентні варіанти до ППП цисплатину та доксорубіцину А2780/DDP та А2780/Dox відповідно. Дані лінії були нами отримані шляхом вирощування вихідних клітин А2780 у культуральному середовищі з додаванням зростаючих концентрацій цисплатину в діапазоні доз від 0,1 до 25 мкг/мл та доксорубіцину в діапазоні доз від 0,01 до 1 мкг/мл. Цисплатин та доксорубіцин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Кожні два місяці проводили тестування досліджуваних клітин для встановлення рівня їх резистентності за допомогою 3-[4,5диметилтіазол-2-1]-2,5-дифенілтетразоліум бромід (МТТ) проліферативного методу. В основу методу покладено здатність мітохондріальних ферментів живої клітини перетворювати 3-[4,5-диметилтіазол-2-1]-2,5-дифенілтетразоліум бромід - сіль жовтого кольору в кристалічний МТТ-формазан лілового кольору [133]. Для цього у лунки 96-лункової планшети з клітинами, які досліджувалися, додавали 20 мкл розчину МТТ (Sigma) (5 мг/мл фосфатно-сольового буферу) та інкубували за тих же умов протягом 3-х годин. Після центрифугування планшету (1500 об/хв, 5 хв), за допомогою полуавтоматичного відсмоктувача видаляли супернатант. Для розчинення кристалів формазану у кожну лунку додавали 100 мкл диметилсульфоксиду (Serva). Величину оптичного поглинання розчину вимірювали за допомогою мультилункового спектрофотометра при довжині хвилі 540 нм (ОП540) і визначали кількість живих клітин.
Величини IC50 (inhibitable concentration 50) для клітин А2780 та A2780/DDP становили 1,25 та 10 мкг/мл цисплатину відповідно, для клітин А2780 та А2780/Dox - 0,25 та 0,1 мкг/мл доксорубіцину відповідно. Таким чином, рівень резистентності до цитотоксичної дії цисплатину клітин лінії A2780/DDP, на час проведення досліджень становив 8, а до цитотоксичної дії доксорубіцину клітин лінії А2780/Dox - 4.
2.1.2 Морфологічні та електронномікроскопічні дослідження
Морфологічні дослідження проводили на цитоцентрифужних препаратах, пофарбованих за Романовським-Гімзою.
Для виготовлення цитоцентрифужних мазків краплю суспензії клітин (106 клітин/мл) наносили на предметне скельце. Скельця поміщали на спеціальні підставки та центрифугували до швидкості 900 об/хв і зупиняли центрифугу. Далі на скельця наносили фарбу за Романовським у розведенні 1:5 на 1 хвилину. Потім, не змиваючи фарбу, на скельця додавали декілька крапель дистильованої води на 30 секунд. Фарбу змивали проточною водою і наносили на скельця розчин Май-Грюнвальда на 45 секунд. Після цього скельця промивали під проточною водою та підсушували. Препарати досліджували за допомогою імерсійної системи мікроскопа Axiophot (Zeiss, Німеччина) при збільшенні 1000.
Для електронномікроскопічного дослідження клітини фіксували у 1,6%-ному розчині глютаральдегду на 0,1М какодилатному буферному розчині (рН 7,3) на протязі 1 години. Для видалення глютаральдегіду клітини відмивали у 0,1 М розчині какодилатного буферу на протязі 16-18 годин. Для досягнення оптимальної ізотонічності фіксуючого та відмиваючого буферів у какодилатний буфер додавали сахарозу з розрахунку 50 мг на мл. Постфіксацію клітин проводили у 2%-вому розчині чотирьохокису осмію, а потім зневожували у спиртах та заливали у аралдіт за загальновживаною методикою [121]. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультратомі LKB-8800, контрастували ураніл-ацетатом та цитратом свинцю та досліджували у електронному мікроскопі JEM-100B при прискорюючій напрузі 80 кV з наступним фотографуванням зразків, що досліджувались.
2.1.3 Імуноцитохімічні методи
За допомогою імуноцитохімічного методу досліджено експресію білків- регуляторів апоптозу - Р53, Bcl-2, CD95/Fas, білків, пов`язаних з лікарською резистентністю - Pgp, GST, МТ, антигену проліферації, а також експресію білків адгезивної системи - Е-кадгеринів.
Досліджені клітини вирощували на покривних скельцях одну добу, потім фіксували в 4%-ному розчині параформальдегіду протягом 20 хвилин. При дослідженні внутрішньоклітинних антигенів проникнення реагентів імуноцитохімічної реакції всередину клітини забезпечували шляхом їх обробки 0,1%-ним розчином тритону Х100 впродовж 10 хвилин при температурі 37оС. Для зменшення неспецифічного забарвлення клітини інкубували 30 хвилин з 1%-ним розчином бичого сироваткого альбуміну (BSA). Визначення експресії даних білків проводили за допомогою моноклональних антитіл (МКАТ) проти P53, Bcl-2, ІПО-38, Fas-антигену, Е-кадгеринів (DakoСytomation, Данія; ІЕПОР, Україна) впродовж 1 години, після чого застосовували ПАП-метод або систему візуалізації EnVision (DakoСytomation, Данія), кон'югованою з лужною фосфатазою або пероксидозою. Через 30 хвилин проводили виявлення активності ферменту за допомогою модифiкованого методу Graham, Karnovsky із застосуванням в якості субстратів ДАБ (3,3`-діамінобензидину cолянокислого) або 3-аміно-9-етилкарбазолу для системи візуалізації EnVision, кон'югованою з пероксидозою, або ПАП-метода [24]. При застосуванні системи візуалізації EnVision, кон'югованою з лужною фосфатазою, проводили цитохімічне дослідження ферменту методом азосполучення за допомогою Fast Red TR (4-Chloro-2-methylbenzene-diazonium salt). Після проведення імуноцитохімічної реакції препарати промивали водою та дофарбовували 0,1%-ним розчином метилового зеленог