РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Вивчення впливу металевих сплавів, які використовуються для виготовлення імплантатів, на проліферативну активність клітин кісткового мозку (in vitro)
Одним із найбільш поширених методів оцінки біосумісності імплантаційних матеріалів і кісткової тканини є вивчення їх впливу на культуру фібробластів стромальних клітин кісткового мозку [1, 80, 128, 171,183, 255, 298].
З цією метою кістково-мозкові клітини отримували із трубчастих кісток лабораторних тварин (кролів) [40, 81, 282]. Під тіопенталовим довенним наркозом в асептичних умовах хірургічним доступом оголювали метаепіфізи стегнових кісток і за допомогою пункційної голки з мандреном та шприца аспірували з медулярного каналу кістки методом ексфузії стромальні кістковомозкові клітини. Отриманий таким чином кістково-мозковий ексфузат поміщали в пробірку з поживним середовищем для клітин периферійної крові "ГЛЮГІЦИР" Львівського філіалу ЦНДІ гематології і переливання крові МОЗ України. Після цього клітинний ексфузат тричі відмивали в розчині Хенкса з лінкоміцином 30% - 2,0 на 250,0 мл. Проводили дисоціацію ексфузату та дезагрегацію клітин повторним п'ятихвилинним пропусканням зависі клітин через пастерівську піпетку. На наступному етапі отриману суспензію фільтрували через капроновий фільтр. Концентрацію клітин, підраховуючи в камері Горяєва, доводили центрифугуванням до 2,0-2,5 *106 в 1 мл3 і висівали на поживне середовище наступного складу: середовище Ігла, модифіковане Дальбеко (ОМЕ "Flow" Labs, Велика Британія), у флакони Карреля на чашці Петрі. Культивування проводили в атмосфері 5% СО2 при 37?С. Для відкріплення клітин від дна культурального посуду використовували суміш 0,1% трипсину (1:250, Serra, Німеччина) та 0,2% р-н версену. На дно культурального посуду поміщали смужки розміром 1,0х6,0-7,0 мм з титану марки ВТ-1,0-2, кобальто-хромової сталі (КХС) та металеві з індій-паладієвим покриттям, попередньо стерилізовані та пасивовані. В іншому варіанті в культуральний посуд вносили оброблені стерильні ошурки з титану, КХС та КХС з індій-паладієвим покриттям розміром 0,2-0,5 мм. Флакони з інтактною культурою, куди нічого не вносили, слугували контролем.
Поживне середовище замінювали через 1 добу від початку культивування, а потім кожні наступні 4 доби. За культурою клітин спостерігали на 4, 7, 11, 15 добу з часу посіву. Культуру, що виводили з експерименту, відмивали від поживного-інкубаційного середовища в розчині Хенкса двічі, після цього фіксували в розчині Мая-Грюнвальда протягом 1,5 хв і забарвлювали за Романовським-Гімза синькою 10 хв [194, 267]. Отримані препарати в флаконах Карреля та чашках Петрі вивчали за допомогою світлооптичної мікроскопії і фіксували на кольоровій фотоплівці F-100 цифровим способом.
2.2. Вивчення реакції кісткової тканини навколо імплантованих металевих штифтів з різних сплавів в експерименті
Вивчали реакцію кісткової тканини на штифти з титану, кобальто-хромового сплаву з індій-паладієвим покриттям та кобальто-хромового сплаву, імплантовані в преангулярному відділі нижньої щелепи 24 кролів (було заплановано 21 тварину, 3 кролі було дооперовано у зв'язку з втратою трьох тварин основної групи) породи шиншила [22, 76] масою 2,5-3,0 кг віком 0,8-1,0 років. Розподіл кролів відносно термінів та матеріалу, з якого були виготовлені штифти, наведені в таблиці 2.1. Усі тварини утримувались за однакових умов віварію Львівського науково-дослідного інституту гематології і переливання крові. При виконанні експериментів дотримувалися Європейської конвенції з захисту хребетних тварин (18.03.1986).
Таблиця 2.1
Розподіл тварин в експерименті за терміном та видами імплантованих металевих штифтів.
Кролі (кіль-кість)Терміни дослідження
(доба)Титанові штифтиШтифти з КХС з індій-паладієвим покриттямШтифти з КХСправий біклівий бікправий біклівий бікправий біклівий бік371111113141111113211111113301111113601111113901111113180111111
Операцію проводили під комбінованим наркозом шляхом довенного та доочеревинного введення 1,0% р-ну тіопенталу натрію із розрахунку 1,0 мл3 розчину на 1 кг маси. Після введення піддослідних тварин у наркоз і підготовки операційного поля в ділянці нижньої щелепи на кожній із сторін (видалення шерсті, обробка шкіри йодинолом та етанолом) проводили відізолювання операційного поля від навколишніх ділянок з дотриманням всіх правил асептики. Після цього лінійним розтином розсікали шкіру в проекції кута та преангулярної ділянки тіла нижньої щелепи. М'які тканини розшаровували, оголюючи кортикальну кісткову поверхню. Вздовж нижнього краю щелепи в преангулярній ділянці за допомогою портативної бормашини спеціально приготованим сталевим свердлом діаметром 1,4 мм формували ложе імплантату при заданій кількості обертів - 1,5 тисячі обертів за хвилину з подачею фізрочину, перфоруючи кортикальну пластинку, та формували глибину дефекту. Після створення ложа імплантату встановлювали досліджувані металеві штифти довжиною 3,5 мм, діаметром 1,5 мм методом вколочення. Ложе імплантату створювали з урахуванням анатомічних особливостей будови нижніх щелеп кролів, а саме надмірно розвинуту у гризунів довжину коренів зубів (рис. 2.1), що сягає нижнього кортикального краю щелеп. З цієї причини нами попередньо на ліофілізованих препаратах щелеп кролів була розроблена схема-модель (рис. 2.2) встановлення імплантатів в міжкореневих проміжках зі сторони нижнього краю щелепи. Операційну рану пошарово ушивали кетгутом та шовком.
Рис. 2.1. Анатомічна будова коренів нижніх бічних зубів кролів
Рис 2.2. Топографо-анатомічні орієнтири та схематичне зображення місця встановлення металевих штифтів у нижню щелепу кролів
Імплантацію проводили з двох боків щелепи - зліва та справа.
Із досліду виводили почергово по 3 тварини методом швидкого введення 1% розчину тіопенталу натрію у вушну вену на 7, 14, 21, 30, 60, 90, 180 добу від терміну прове