ГЛАВА 2
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Общая характеристика работы
В работе использовались крысы самцы линии Вистар. Животные обеспечивались
стандартным рационом питания и содержались при 24оС в условиях естественного
освещения в помещении вивария Харьковской медицинской академии последипломного
образования.
В исследованиях использовалось 157 крыс. Все животные делились на две
возрастные группы: взрослые половозрелые – 10 - 12 месяцев (масса 240 - 360 г)
и молодые в периоде полового созревания – 1,5 месяца (масса 80- 90 г). Каждая
группа, в свою очередь делилась на четыре подгруппы:
1 – интактные (взрослые - 27; молодые - 27);
2 – крысы, которые подвергались интенсивной физической нагрузке (плаванью до
“отказа”) (взрослые - 18; молодые - 18);
3 – животные, у которых воспроизводился экспериментальный гипотиреоз (взрослые
- 18; молодые - 16);
4 – крысы с экспериментальным гипотиреозом, которые подвергались интенсивной
физической нагрузке (взрослые - 17; молодые - 16).
В процессе проведения исследований соблюдались все требования “Правил
проведения работ с использованием экспериментальных животных“.
2.2. Характеристика использованных экспериментальных моделей
Для воспроизведения модели интенсивной физической нагрузки крысы подвергались
плаванью до “отказа”. С этой целью они помещались в круглые пластиковые емкости
диаметром 40 см, заполненные подогретой водопроводной водой. Глубина емкости
для 1,5-месячных крыс составляла 19 см, а глубина емкости для 12-месячных крыс
составляла 50 см. Температура воды поддерживалась на уровне 20оС. Через 1 час
после прекращения плаванья животные подвергались эвтаназии.
Модель экспериментального гипотиреоза воспроизводилась при помощи
антитиреоидного препарата мерказолила. Для этого животным проводилось
внутрибрюшинное введение мерказолила на физиологическом растворе хлористого
натрия из расчета 1 мг препарата на 100 г массы животного [152]. Раствор
мерказолила вводился ежедневно утром в течение 15 дней.
Эффективность воспроизведения экспериментального гипотиреоза контролировалась
по концентрации в крови тиреоидных гормонов (Т3 и Т4), а также тиреотропного
гормона передней доли гипофиза (ТТГ). Полученные результаты представлены в
Главе 3.1.
2.3. Подготовка проб для проведения исследований и субклеточное
фракционирование гомогенатов печени
Эвтаназия проводилась путем декапитации под легким эфирным наркозом.
Извлекалась печень и собиралась кровь.
Кровь использовалась для получения сыворотки, в которой далее проводилось
исследование концентрации тиреоидных гормонов и карбонилированных белков.
Печень перфузировалась охлажденным физиологическим раствором хлористого натрия,
отмывалась от крови и немедленно помещалась в охлажденный до 0о C
физиологический раствор, находящийся в емкости, помещенной в ледяную баню.
Для получения субклеточных фракций, навески ткани печени извлекались их
охлажденного физиологического раствора, отжимались на марлевой салфетке,
взвешивались на торсионных весах и тщательно измельчались ножницами. После
этого они гомогенизировались в течение 30 секунд (25 - 30 движений пестика) в
стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с тефлоновым пестиком при
отношении массы ткани к объему среды выделения соответствующем 1:10.
Среда выделения представляла собой 0,25 М раствор сахарозы (рН 7,4).
Приготовленные гомогенаты фильтровались через 2 слоя марли и центрифугировались
в течение 10 минут при 1000 g в центрифуге ЦЛ-310b (Польша). Надосадочная
жидкость повторно центрифугировалась при 10000g в течение 20 минут в угловом
роторе рефрижераторной центрифуге РС-6. Осадки, полученные после
центрифугирования при 10000g, суспензировались с 5 мл среды выделения и
подвергались повторному осаждению при аналогичном режиме центрифугирования.
Очищенный таким образом осадок суспензировался с 1 мл среды выделения и
использовался в исследованиях в качестве грубой митохондриальной фракции.
Супернатант, полученный после осаждения пробы при 10000g, использовался в
работе в качестве постмитохондриальной фракции, а также для получения
микросом.
С целью получения микросом в пробы постмитохондриальной фракции вносилась смесь
растворов хлористого кальция и хлористого магния, до конечных концентраций 8 мМ
и 5 мМ соответственно [7]. Образцы в течение 20 минут выдерживались при 4оС,
после чего подвергались центрифугированию при 2000g в течение 10 минут.
Осадок, представляющий собой микросомальную фракцию печени, суспензировался с 1
мл среды выделения.
Все процедуры, связанные с фракционированием гомогенатов печени, проводились
при 0 - + 040 С. Схема фракционирования гомогенатов представлена на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Схема фракционирования гомогенатов печени.
Пробы митохондриальной, постмитохондриальной и микросомальной фракции печени до
проведения исследований хранились в замороженном состоянии при –200 С.
2.4. Исследование состояния свободнорадикальных процессов
Для оценки состояния свободнорадикальных процессов в печени, в них измерялось
содержание продуктов свободнорадикального окисления белков и липидов, а также
определялась интенсивность индуцированного свободнорадикального окисления
белков и липидов
2.4.1. Определение содержания продуктов свободнорадикального окисления липидов
и белков. В гомогенатах печени и ее субклеточных фракциях исследовалось
содержание продуктов свободнорадикального окисления липидов (диеновых
конъюгатов и шиффовых оснований) и белков (карбонилированных белков).
2.4.1.1. Исследование концентрации продуктов свободно-радикального окисления
липидов. Образцы суспензий субклеточных фракц
- Київ+380960830922