ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Работа выполнялась в Луганском государственном медицинском университете на
кафедре медицинской химии (зав. кафедрой – проф. И.А.Комаревцева).
2.1. Клиническая характеристика больных раком почек.
В процессе работы мы обследовали 54 больных опухолями почек. Согласно
классификации TNM, больные злокачественными новообразованиями почек имели
стадии опухолевого процесса: T1N0M0 - 1 (1,9%); T2N0M0 – 13 (25%); T2NxM0 – 4
(7,8%); T3N0M0 – 15 (28,8%); T3N2M1 – 1 (1,9%); T3N3M0 – 1 (1,9%); T3NxM0 – 6
(11,6%); T3ANxM0 - 1 (1,9%); T4N0M0 – 1 (1,9%); T4N1M0 – 1 (1,9%); T4N2M0 – 1
(1,9%); T4NxM0 – 4 (7,8%); T4N0M1 – 2 ( 3,8% ); T4NxM1 – 1 ( 1,9% ). У 2
больных – установлены доброкачественные фибромы почек. У детей с опухолью
Вильмса стадия опухолевого процесса была T2N0M0 – 8 (100%).
Больные всех клинических групп находились на обследовании в урологическом
отделении Луганского областного онкологического диспансера и урологическом
отделении Луганской областной детской больницы, а здоровые добровольцы -
амбулаторно и частично в стационаре. В период обследования была проведена
углубленная биохимически-инструментальная диагностика с внедрением предложенных
нами радиоиммунологических методов. Для синхронизации научного анализа
имеющихся патологических процессов наше обследование начиналось со вторых суток
пребывания в стационаре всегда в одно и то же время (9 часов утра) до начала
терапевтических или хирургических мероприятий, в период клинико-лабораторных и
инструментально-диагностических методов обследования. Обычно это были
стандартные, общепринятые методы обследования, но наряду с ними, в зависимости
от профилизации, применялись и специфические методы исследования. Всем больным
была проведена ультразвуковая диагностика почек трансабдоминальным секторальным
датчикам (3,5 и 5 Гц) фирмы «Brul @ Kaer» (Дания) в сопоставлении с
хромоцистоскопией и экскреторной урографией. Для пункционной биопсии почек под
ультразвуковым (УЗ) контролем использовалась специальная направляющая насадка
на датчик для точного попадания в зону-мишень. Применялись иглы фирмы «СООС»
(Франция) с «выкусывателем» достаточного для гистологического исследования
количества тканей.
В отдельных случаях, при затрудненном диффдиагнозе, больным проводилось
Магнитно-резонансная томография (МРТ),
Обследования больных и здоровых доноров проводились в осенне-зимнее время, о
чем свидетельствуют записи в историях болезни и амбулаторных картах, с учетом
сезонных ритмов. Женщины обследовались в предовуляционном периоде
менструального цикла, не применявшие способов гормональной контрацепции.
Таблица 2.1.1.
Распределение больных по клиническим группам и количество методик и анализов
обследования.
Группы обследованных
Число обследован-ных
Число выполненных методик и анализов
Контрольная группа здоровых доноров на диете с нормальным содержанием натрия
(80-120 ммоль/сут) в возрасте 18-55 лет
62
1564
Больные раком почек
54
1134
Больные с неопухолевым процессом почек
Всего:
116
26980
Характеристика клинических групп и количество проведенных биохимических,
радиоиммунологических и инструментальных методик представлены в табл. 2.1.1.
2.2. Количественное определение ДНК-фрагментации и клеточной пролиферации.
Детекция апоптоза осуществлялась по выявлению ДНК-фрагментации в биоптатах
опухоли [70]. Один из широко используемых подходов для определения ДНК основан
на цветной реакции с дифениламиновым реагентом.
Для определения процентного содержания фрагментированной ДНК некоторые авторы
[68] предлагают сначала получать гомогенат ткани в сахарозной среде выделения
(рН = 7,4), а затем проводить инкубацию в лизис-буфере (рН=8) с последующим
разделением ДНК на фракции центрифугированием при 13000 g. В работе [92]
описана аналогичная методика, но с разделением интактного хроматина от
фрагментированной ДНК центрифугированием при 27000 g.
Метод выделения и определения ДНК с использованием протеиназы К и ТЕ-буфера
[67,69] достаточно прост, но дорогостоящий и не позволяет зарегистрировать
фракцию поврежденной ДНК .
Предлагается метод определения фрагментации ДНК в тканях с дифениламиновым
реагентом, но в нашей модификацией [66]. Ее суть заключается в том, что
гомогент ткани сразу готовится в лизис-буфере (рН = 8). Этот метод по сравнению
с ранее упомянутыми является более экспрессным и дешевым.
Биоптаты опухолевой ткани взвешивались, предварительно измельченная ткань
помещалась в гомогенизатор с тефлоновым пестиком. В качестве среды выделения
использовался лизис-буфер (5 мМ Tris HCl, 20 мМ ЕДТА (рН = 8), 0,5 % Triton
X-100) в объемном соотношении 1: 9. Гомогенат готовился при t = 4оС. Аликвоту
каждой пробы центрифугировали в течение 15 мин при 13000 g, отделяя интактный
хроматин (осадок) от фрагметированной ДНК (супернатант). Затем пробы
ресуспензировали в 500 мл ТЕ-буфера (10 мМ Tris HCl, 1 мМ ЭДТА, рН = 8) и
преципитировали в 600 мл 12 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ) при t = 4оС. Далее
преципитаты центрифугировали при 4000 g 10 мин и супернатант отбрасывали.В
пробирки с осадком добавляли по 300 мл 5 % ТХУ и проводили гидролиз на водяной
бане при 90оС в течение 10 мин. Затем пипеткой осторожно из пробирок отбирали
супернатант. После охлаждения в пробирки с супернатантом добавляли
дифениламиновый реагент в объемном соотношении 1:2. Максимальное развитие
окраски достигалось через 17-18 часов при комнатной температуре.
Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию ДНК в пробе. После
проведения цветной реакции аликвоты раствора переносили в кюветы
спек