РОЗДІЛ 2 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт дослідження
Для дослідження були використані прищитоподібні залози, кісткова тканина
(стегнові кістки) та кров 30 морських свинок, яких розділили на три вікові
групи: І група – 3 міс., ІІ група – 1 рік, ІІІ група – 3 роки; у кожній групі
по 5 самців та 5 самок. Тварини утримувались у стандартних умовах віварію.
Показники маси, довжини тіла та окружність грудної клітки відповідали даним
відповідних вікових груп [37]. Для одержання матеріалу тварин піддавали
ефірному наркозу згідно правил проведення робіт з використання лабораторних
тварин (1977), Конвенції ради Європи про охорону хребетних тварин, що
використовують в експериментах та інших наукових цілях (1986), Директиви ЄЕС
3 609 (1986) та Наказу МОЗ України № 281 від 01.11.2000 р. “Про міри по
подальшому вдосконаленню організаційних норм роботи з використанням
експериментальних тварин”.
Аутопсійний матеріал прищитоподібних залоз та кісткової тканини (з ділянки
верхньої передньої клубової ості) чоловіків та жінок різних вікових груп
отримували у Львівському обласному патологоанатомічному бюро та у приватній
діагностичній лабораторії “Біоптат” у процесі проведення поточних розтинів при
відсутності в анамнезі та патоморфологічному заключенні хвороб, що могли
вплинути на результати проведених досліджень. Весь матеріал було розділено на 4
вікові групи (згідно класифікації ВООЗ): І група, люди зрілого віку (30–44р.),
ІІ група, середній вік (45-59р.), ІІІ група, похилий вік (60-74р.), IV група,
старечий вік (75-90р.), окремо чоловіки (n = 20) та жінки (n = 20). Кров на ПТГ
досліджували у 77 умовно здорових осіб.
Операційний матеріал гіперплазованих та пухлинно змінених ПЩЗ (n = 10) у
вигляді парафінових блоків при констатованому патоморфологічному діагнозі
(гіперплазія, аденома, рак ПЩЗ) отримували з дотриманням етичних норм
(патоморфологічні дослідження проведені доц. В.І. Вовком та доц. Ю.В.
Бісяріним, зав. кафедри патологічної анатомії, проф. Ю.О. Поспішіль).
Загальногістологічні і морфометричні методи дослідження прищитоподібних залоз
та кісткової тканини
Прищитоподібні залози тварин та людини фіксували у 4 % нейтральному формаліні
впродовж 24 год, промивали у проточній воді (24 год), зневоднювали у спиртах
зростаючої концентрації (70о ... 96о), ущільнювали у парапласті та заливали у
блоки. Виготовляли зрізи товщиною 6-7 мкм, які фарбували гематоксиліном та
еозином для загальноморфологічних досліджень.
Кісткову тканину фіксували у 4 % нейтральному формальдегіді впродовж доби,
декальцинували у 7% розчині азотної кислоти, змінюючи його через кожні 48 год
та одночасно контролювали ступінь декальцинації препарувальною голкою. З метою
запобігання набухання тканин і часткової нейтралізації матеріал переносили у 5%
розчин алюмо-калієвих галунів на 48 год, промивали у водопровідній воді
впродовж доби та заливали в парапласт, виготовляли серійні зрізи товщиною 7
мкм. Для загальногістологічних досліджень зрізи зафарбовували гематоксиліном та
еозином [24]. Шліфи кісток виконували згідно з відповідною методикою [105].
Для оцінки вмісту ДНК та РНК у цитоплазмі та ядрах (нуклеїнові кислоти – НК)
паратироцитів тварин та людини проводили зафарбування по Ейнарсону, специфічної
методики з використанням реактиву галоціаніну на основі калієво-хромового
галуна [24]. При цьому 5,0 г калієво-хромового галуна розчиняли у 100 мл
дистильованої води з додаванням 0,15 г галоціаніну. Далі кип’ятили протягом 5
хв. та після охолодження фільтрували. Кількість утвореного фільтрату доводили
до 100 мл. Для одержання рН = 1,65 до 40 мл вихідного розчину галоціаніну
додавали 10 мл 1М розчину соляної кислоти. Зрізи товщиною 5-6 мкм після
депарафінації та проведення через спирти доводили до води і фарбували у свіжо
приготованому розчині галоціаніну впродовж 24 год, далі промивали у
дистильованій воді, зневоднювали у спиртах, просвітлювали у трьох порціях
ксилолу та заключали у канадський бальзам.
Ступінь синтетичних процесів оцінювали напівкількісним методом за інтенсивністю
гістохімічної реакції, яку виражали у плюсах: - відсутність реакції, + слабка
реакція, ++ помірна реакція, +++ сильна реакція.
При виконанні морфометричних досліджень проводили підрахунок [1]:
а) маси, довжини тіла, об’єм грудної клітки морських свинок;
б) кількісне співвідношення головних та оксифільних паратироцитів (%);
в) середнього діаметру ядер головних паратироцитів, у відносних одиницях
(в.од.);
г) визначення об’єму ядер паратироцитів (мкм3) проводили за формулою:
V=1/6 x ? x D x d2
де ? – (3,14159…)
D – найбільший діаметр ядра паратироцита;
d – найменший діаметр ядра паратироцита.
Лектиногістохімічні методи вивчення прищитоподібних залоз та кісткової тканини
При використанні залитого у блоки гістологічного матеріалу ПЩЗ та КТ тварин та
людини виготовляли серійні зрізи, які поміщали на чисті, попередньо знежирені
та небілковані предметні скла, висушували впродовж доби при 37оС у сушильній
шафі та зафарбовували прямим лектиногістохімічним методом (Луцик А.Д. и др.,
1989).
Для ідентифікації глікокон’югатів використовували набір із шести лектинів,
очищених із сировини Карпатського регіону, мічених пероксидазою хрону,
отриманих у лабораторії “Лектинотест” Львівського національного медичного
університету імені Данила Галицького, очолюваної д.фарм.н. В.О. Антонюком
(табл. 2.1).
Препарати депарафінували у трьох порціях ксилолу (3 x 10 хв.), переносили у
етиловий спирт 96o (10 хв.), метанол з додаванням Н202 – 0,3% розчин (30 хв.),
спирт 70o (10 хв.). Після спиртів скельця промивали у двох порціях забуференого
інкубаційного розчину
- Київ+380960830922