<p>ГЛАВА 2<br /> ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ<br /> <br /> 2.1. Объем исследований<br /> В качестве материала для исследования полиморфизма мтДНК использовали образцы периферической крови, которые были собраны сотрудниками ХСМГЦ среди неродственных лиц (студенты медицинского университета и курсанты военной академии), проживающих на территории Украины. Сбор образцов проводился с соблюдением процедуры информированного согласия и указанием данных о месте рождения. Этническая принадлежность исследованных индивидов выяснялась с помощью устного анкетирования, при этом считалась существенной принадлежность к указанной этнической группе в 3-м поколении.<br /> Общая выборка составила 239 индивидов, из них 90 являлись жителями г.Харькова (контрольная группа, которая использовалась для сравнительного анализа с выборкой пациентов), остальные 149 были представлены выходцами из разных городов и областей Украины: Луганск (24), Донецк (31), Николаев (2), Одесса (1), Херсон (2), Запорожье (4), Крым (14), Ровно (4), Тернополь (1), Львов (6), Черновцы (2), Ивано-Франковск (1), Хмельницкий (1), Закарпатье (1), Житомир (4), Киев (6), Чернигов (3), Сумы (7), Винница (3), Черкассы (3), Кировоград (1), Полтава (10), Днепропетровск (18) (рис.2.1). <br /> Материалом для исследования полиморфизма индивидуальных геномов мтДНК послужили образцы периферической крови 50 пациентов (клинически гетерогенная группа) из г.Харькова, состоящих на учете в ХСМГЦ с клиническим диагнозом - митохондриальная болезнь. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /><br />Рис. 2.1 *Регионы локализации образцов<br /> <br /> Диагноз был выставлен на основе клинико-генетических, клинико-генеалогических, сомато-генетических исследований, проведенных сотрудниками кафедры медицинской генетики ХГМУ - доцентами Ю.Б.Гречаниной и Е.П.Здыбской и заведующей отделением детской психоневрологии ХСМГЦ - Н.П.Федосеевой. Диагноз подтвержден д.мед.н., профессором, чл.-корр. АМНУ Е.Я.Гречаниной. <br /> <br /> 2.2. Методы исследований <br /> Анализ изменчивости высокополиморфных генетических систем, к числу которых относится мтДНК, является наиболее перспективным подходом для изучения генетической истории отдельных народов и их общностей [16]. Исследование полиморфизма мтДНК проводилось в несколько этапов с использованием следующих методов: <br /> А) Метод выделения ДНК. Для получения образцов ДНК использовали два варианта методик. По одному варианту тотальная ДНК выделялась из цельной крови методом фенольной экстракции [99]. Лизис 200 мкл крови проводился в 300 мкл лизирующего буфера (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH=8,0, 10mM ЭДТА, 1% SDS, протеиназа К в концентрации 0.2 мг/мл) в течение 12-16 часов при 37°С. После инкубации лизат депротеинизировали последовательно фенолом, фенол/хлороформом и хлороформом. Затем депротеинизированную ДНК концентрировали осаждением в этаноле. Для оценки качества и количества выделенной ДНК проводился электрофорез в 1% агарозных гелях и детекция ДНК в УФ-свете после окрашивания гелей бромистым этидием. Раствор ДНК хранился при -20°С. <br /> По второму варианту тотальная ДНК выделялась из цельной крови с использованием методики солевой преципитации согласно инструкции фирмы-производителя. Для лизиса 1 мл крови использовали три вида лизирующих буферов. Сначала лизис образцов проводили в 6 мл лизирующего буфера A-LYSISBUFFER (83 гр NH4Cl, 10 гр KHCO3, 20 мл 0,5mM EDTA Na2) в течение 30 минут при -20°С. После центрифугирования к осадку добавляли 500 мкл 25% NP-40 и 8 мл второго лизирующего буфера TKM 1 BUFFER (10 мл 1мМ Tris, 10 мл 1mM KCl, 5 мл 2mM MgCl2, 4 мл 0,5 mM EDTA Na2). Инкубировали образцы 12 часов при -20°С. По истечении указанного времени, образцы вновь центрифугировали и к осадку добавляли 400 мкл 10% SDS и 4 мл третьего лизирующего буфера TKM 2 BUFFER (5мМ NaCl и ТКМ 1). Образцы инкубировали 20 минут при +56°С. Депротеинизированную ДНК концентрировали осаждением в 96% этаноле, а затем промывали в охлажденном 70% этаноле в течение 20 минут. <br /> Для получения большого числа копий фрагментов ГВС I мтДНК полученные образцы выделенной нативной ДНК амплифицировали с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). <br /> Б) Метод ПЦР. Реакция амплификации ГВС I мтДНК осуществлялась на амплификаторе "MyCycler" ("Biorad") с использованием праймеров: L15997: 5'-CACCATTAGCACCCAAAGCT-3' и H16401: 5'-TGATTTCACGGAGGATGGTG - 3', номера праймеров соответствуют позиции 3'-конца согласно опубликованной последовательности мтДНК человека [31]. Для проведения ПЦР готовили реакционную смесь из расчета на 1 образец, объемом 25 мкл (10х буфер - 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 10мМ dNTP - 0,25 мкл; по 0,5 мкл каждого из праймеров (10 pmol); Taq-полимераза - 0,15 единицы; 1-2 мкл тотальной ДНК, Н2О (MQ) - 17 мкл). <br /> Использовалась программа амплификации со следующим температурным режимом: 94°C, 2 мин.; 94°C, 15 сек.; 56°C, 20 сек.; 72°C, 1 мин.; 72°C, 3 мин.; 4°C, пауза в течение 36 циклов. Оценку продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с последующей детекцией в УФ-свете.<br /> В) Метод секвенирования (определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК). Этот метод позволил нам определить нуклеотидные последовательности ГВС I контрольного региона некодирующей области мтДНК для проведения анализа данных по полиморфизму мтДНК в сравнении с европейскими и азиатскими популяциями [38,103].<br /> Продукты ПЦР для постановки сиквенсовой реакции были очищены экстракцией набором "QIAEX II" (Qiagen) в соответствии с рекомендациями изготовителя (1/9 - Exonuclease I/SAP). Использовалась следующая программа очистки: 37°C, 20 мин.; 80°C, 15 мин. Нуклеотидные последовательности ГВС I контрольного региона мтДНК образцов украинцев определялись на автоматическом секвенаторе ABI 3730 с использованием набора Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems).<br /> Сиквенсовую реакцию проводили в следующем составе: Kit</p>
- Київ+380960830922