РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА УМОВИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДІВ
Представлений у дисертації матеріал одержано в результаті досліджень, які проводили в 2001 - 2006 рр. в лабораторії біологічної трансформації азоту і фосфору Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН та на базі дослідного господарства інституту.
2.1. Методи досліджень
Постановку дослідів, їх ведення, облік урожаю проводили у відповідності з існуючими вимогами [224, 225].
Бактерії роду Azospirillum для досліджень вирощували в умовах культивування на мікробіологічній коливалці при 180 об./хвилину на рідкому поживному середовищі, рекомендованому для азоспірил [226], такого складу (%):
кукурудзяний екстракт - 2;
меляса - 3;
вода водопровідна - 95.
рН до стерилізації - 7,0.
В дослідженнях використовували біогумус (вермикомпост), одержаний згідно з технічними умовами (ТУ У 64.4688624-02-91) [227].
Рістстимулювальну активність культуральної рідини Azospirillum
brasilense 410 визначали в лабораторних умовах за допомогою специфічних біотестів: для визначення ауксинової активності використовували відрізки колеоптилів пшениці сорту Подолянка [228], для визначення цитокінінової активності - ізольовані сім'ядолі огірка сорту Джерело [229].
Рістстимулювальну активність водної витяжки біогумусу (субстрату) в процесі вермикомпостування визначали згідно методики О.Берестецького на проростках кукурудзи [230].
По мірі формування вермикомпосту, чашковим методом в динаміці визначали чисельність мікроорганізмів у субстраті: кількість амоніфікувальних бактерій досліджували на середовищі МПА, мікроорганізмів, що засвоюють мінеральні форми азоту - на крохмало-аміачному агарі [231].
Облік чисельності азотфіксувальних мікроорганізмів проводили методом граничних розведень за використання ацетиленового тесту [232] на напіврідких середовищах Доберейнер і Ешбі.
Кількість мікроорганізмів, що розчиняють мінеральні сполуки фосфору та гідролізують органічні фосфати, визначали на середовищі Муромцева з ортофосфатом кальцію або з гліцерофосфатом кальцію відповідно згідно з існуючими рекомендаціями [233].
Чисельність полісахаридутворювальних мікроорганізмів досліджували чашковим методом на середовищі рекомендованого складу [234]. Накопичення екзополімерів у вермикомпості визначали за описаними методами [235].
Чисельність целюлозоруйнівних бактерій визначали методом серійних розведень: аеробних - на середовищі Імшенецького та Солнцевої, анаеробних - на елективному для целюлозоруйнівних анаеробів середовищі [236].
Чисті культури азотфіксувальних бактерій виділяли з біогумусу за загальноприйнятими методиками [234]. Бактерії роду Azospirillum ізолювали згідно з методикою Ф.Касераса [237]. Оцінку нітрогеназної активності чистих культур мікроорганізмів проводили ацетиленовим методом у модифікації М.Умарова [238].
Чисті культури фосфатмобілізувальних бактерій виділяли з вермикомпосту на середовищах Муромцева з ортофосфатом та з гліцерофосфатом кальцію [233]. Здатність виділених культур до розчинення фосфатів кальцію визначали за методом Л.Ердеі [239].
Ідентифікацію виділених культур проводили на основі вивчення морфологічних (фазово-контрастна мікроскопія), культуральних і фізіолого-біохімічних ознак та з використанням визначника Берджі [240].
Досліджуючи особливості мікробного ценозу ризосфери картоплі, вирощуваної в умовах польових дослідів, загальну чисельність мікроорганізмів у ризосферному ґрунті визначали чашковим методом на ґрунтовому агарі [232]. При визначенні кількості азотфіксувальних та фосфатмобілізувальних мікроорганізмів використовували вищенаведені методи. Чисельність мікроміцетів визначали чашковим методом на підкисленому середовищі Чапека [231].
Для вивчення ступеню приживаності бактерій Azospirillum brasilense 410 на коренях картоплі застосовували метод генетичного маркування популяцій [241]. Антибіотикостійкі мутанти одержували за методом В.Зібальського [234], використовуючи градієнт концентрації стрептоміцину в агарі. Одержаними мутантами, які мали стійкість до стрептоміцину в дозі 2000 мкг/мл середовища і зберігали її при пересівах, інокулювали бульби картоплі і після відповідних строків вирощування рослин у динаміці визначали чисельність стрептоміцинстійких клітин у ризосферному ґрунті і на коренях картоплі чашковим методом на селективному середовищі Касераса, яке містило стрептоміцин у концентрації 2000 мкг/мл. Вказані методи використані і в дослідженнях з визначення терміну зберігання біограну.
Для електронно-мікроскопічних досліджень псевдобульбочок на коренях рослин картоплі, вирощених в умовах in vitro, кореневу систему відмивали від агару та фіксували 48 годин у 5 %-му глютаровому альдегіді і 2 години в 2 %-му розчині OsO4. Після зневоднення в серії розчинів етанолу зростаючої концентрації та абсолютному ацетоні зразки заключали в епон 812. Зрізи готували на ультрамікротомі ВS 490А і проглядали в електронному мікроскопі Tesla-540.
Потенційну активність азотфіксації - активність, що відмічається при створенні для азотфіксувальних мікроорганізмів оптимальних режимів вуглецевого живлення, вологи і температури, вивчали у вегетаційних та польових дослідах у ризосферному ґрунті з додаванням розчину глюкози [238] та на відмитих коренях у напіврідкому живильному середовищі Ешбі та Доберейнер [242]. При цьому редукцію ацетилену визначали на хроматографі "Chrom-4" з полум'яно-іонізаційним детектором на колонці з ?-?-оксидіпропіонітрилом. Температура термостату - 50 оС, витрата газів (мл/хв.): водень - 30, азот - 100, повітря - 500.
Потенційну активність денітрифікації в ризосферному ґрунті картоплі вивчали ацетиленовим методом при додаванні розчину глюкози та нітрату калію [236]. Редукцію закису азоту визначали на хроматографі "Цвет-560 М" з детектором теплопровідності (струм мосту 200 mA) на колонці з сорбентом Полісорб-1. Температура колонки - 25оС, детектора - 40 оС, витрата газу (гелію) - 20 мл/хв.