РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика лабораторних тварин
Дослідження виконані на 270 статевозрілих нелінійних самцях білих щурів, масою тіла 0,20-0,25 кг. Утримували тварин у звичайних умовах віварію на стандартному харчовому раціоні з вільним доступом до води та їжі, при температурі приміщення 20-22°С.
Усі експерименти проведені в осінній період, оскільки за літературними джерелами, це є період стабільної сезонної активності кори надниркових залоз [240].
Вибір статі тварин зумовлений більшою вразливістю нейроендокринної регуляції стрес-реактивності у самців [10, 64]. У самок адаптивні системи більш чутливі до дії фізіологічних стресів і відповідно забезпечують більш досконалу адаптацію до гострих стресорів [10]. Статевий диморфізм у щурів проявляється в стрес-індукованій секреції катехоламінів та глюкокортикоїдів.
Вагоме значення в обмеженні стресорних пошкоджень має антиоксидантна система, яка виступає в ролі периферичної стрес-лімітувальної ланки, обмежує зростаючу під час стресу інтенсивність ПОЛ [115]. Мобілізація під час стресу антиоксидантної системи самок також свідчить про більшу захищеність особин жіночої статі.
Таким чином, адаптивні системи самок більш динамічні, надійні і мають більшу резервну потужність, а отже саме у самців легше виявити нейрохімічні, ендокринні та морфологічні кореляти зрушень, викликаних впливом стресу.
Під час досліджень дотримувалися Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000р. "Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин". Досліди проведені відповідно до вимог комісії з білетики Буковинського державного медичного університету (протокол №3 від 16.02.2005).
2.2. Формування експериментальних груп
Нами проведено три серії експериментів: І серія - визначення морфофункціонального стану надниркових залоз при дії іммобілізаційного стресу на фоні фізіологічної активності ШЗ; ІІ серія - визначення морфологічних та функціональних особливостей будови надниркових залоз в умовах стресу на фоні гіперфункції ШЗ; ІІІ серія - визначення морфофункціонального стану надниркових залоз при стресі на фоні гіпофункції ШЗ.
Тварини кожної з серій досліду розподілені на три експериментальні групи: 1 група (контрольна) - інтактні щури, які виводилися з експерименту одночасно з дослідними тваринами для визначення контрольних показників; 2 група - щури, яким моделювали гострий іммобілізацій ний стрес; 3-ю групу складали тварини, яким за одну годину до стресу вводили епіталон.
Інтактним тваринам епіталон не уводили, оскільки згідно літературних даних він не викликає в них ніяких змін [139, 155].
З метою з'ясування шляхів корекції стрес-зумовлених морфофункціональних змін надниркових залоз залежно від активності ШЗ, застосовано синтетичний аналог пептидних препаратів ШЗ (епіталон).
Для встановлення циркадіанних особливостей морфології та функціонування надниркових залоз, у кожній з серій експериментів проводили дослідження о 08.00, 14.00, 20.00 та 02.00 годинах.
2.3. Постановка досліду
При проведенні досліджень дотримувалися Правил проведення робіт з використанням лабораторних тварин (1977), Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовують в експериментах та інших наукових цілях (1986), Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000р. "Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин".
Стрес моделювали шляхом фіксування тварин в спеціальних пластикових клітках-пеналах протягом однієї годині. Клітки спеціально призначені та пристосовані для іммобілізації щурів.
Тварини, яким проводили дослідження на фоні фізіологічної активності ШЗ, знаходились при звичайному режимі освітлення (12.00С:12.00Т). Моделювання гіперфункції ШЗ проводили шляхом цілодобового утримування тварин в умовах постійної темряви впродовж 7 діб (0С:24.00Т). Цю серію експериментів здійснювали при інфрачервоному світлі, яке не викликає активації пінеалоцитів. Гіпофункцію залози викликали утримуванням тварин при постійному освітленні інтенсивністю 1000 люкс протягом 7 діб (24.00С:0Т).
Щурам 3-ої групи кожної з експериментальних серій за одну годину до моделювання іммобілізаційного стресу уводили епіталон в дозі 0,5 мкг на тварину. Епіталон отриманий для досліджень з Санкт-Петербурзького Інституту геронтології і біорегуляції СЗО РАМН.
Тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під легким ефірним наркозом.
2.4. Методи досліджень та їх обґрунтування
Після декапітації тварин фіксували, на препарувальних дошках. Для гістологічного дослідження матеріал забирали у тварин всіх груп. Забирали одну надниркову залозу і фіксували її в 10%-ому розчині нейтрального формаліну з трьохразовою заміною фіксатора, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, після чого заливали в парафінові блоки. Виготовляли гістологічні зрізи товщиною 5-6 мкм та зафарбовували гематоксилін-еозином.
Для аналізу та характеристики гістологічних змін надниркових залоз проводили їх морфометрію. Для цього використовували ліцензійну програму для аналізу цифрових зображень "ВидеоТест-Размер 5.0" (ООО ВидеоТест, Росія). Зображення зрізів надниркових залоз з виготовлених мікропрепаратів отримували за допомогою системи, що складається з фотокамери "OLYMPUS C740UZ", мікроскопа "ЛЮМАМ-Р8", USB-кабелю та персонального комп'ютера "Celeron 2.4 MHz".
У ході гістологічного аналізу визначали такі показники: площу клітин (S клітин) кіркової та мозкової речовин, площу ядра (S ядра), ядерно-цитоплазматичний індекс (ЯЦІ), товщину кіркової речовини (Н кіркової речовини).
Для електронно-мікроскопічного дослідження мозкової та кіркової речовини надниркових залоз забір матеріалу проводили згідно загальноприйнятих правил [154]. Для дослідження з надниркової залози вирізали тонку, суцільну пластинку тов