РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2. 1 Схема досліджень
Дисертаційна робота виконувалась протягом 2002-2005 років у лабораторії обміну речовин, дослідному господарстві "Чишки" Інституту біології тварин УААН та господарстві "Прут-генетик" Коломийського р-ну Івано-Франківської області. Усього проведено 5 серій досліджень.
Зокрема 1, 2 і 3 серії досліджень проводились за умов in vitro. Для цього у дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН "Чишки", із бичків-аналогів української чорно-рябої молочної породи було сформовано дослідну групу тварин. Годівлю телят здійснювалали згідно норм рекомендованих (ВАСХНІЛ, 1985), утримання тварин було прив'язне. Накладання фістул на рубець телят проводилось у 20-денному віці. Перед проведенням хірургічної операції тварини протягом 24-х годин витримувались на голодній дієті. Для наркозу використовували 33 %-ний розчин етилового спирту, який підігрівали до температури 38 єС і вводили внутрішньовенно в кількості 200 мл на голову. На підготовленому операційному полі (вистригання шерсті, дезинфекція, стерильне полотно) проводили інфільтраційну анестезію 1 %-ним розчином новокаїну. До операції приступали в стані повного наркозу тварини. Фістулу на рубець телят накладали з лівої сторони в ділянці "голодної" ямки, методом який протягом багатьох років використовувався в лабораторії обміну речовин Інституту біології тварин УААН.
Об'єктом біохімічних досліджень слугував вміст рубця, який відбирали через 2 години після ранкової годівлі тварин, за допомогою приладу, виготовленого на основі колби Бунзена та вакуумної помпи Косовського. Відібраний вміст фільтрували через 4 шари марлі і доставляли у щільно закритому термосі в лабораторію. Отримане вмістиме використовували для інкубації у живильному середовищі з додаванням досдіджувваних субстратів. Після інкубації відбирали зразки газів та рідини для аналізу.
Метою першої серії досліджень було вивчити вікову динаміку утворення метану та вплив коротколанцюгових карбонових кислот (мурашиної, оцтової, пропіонової) у молодняка великої рогатої худоби. Дослідження проводилися в лабораторії обміну речовин і дослідному господарстві "Чишки" Інституту біології тварин УААН на трьох бичках-аналогах. Зразки вмістимого відбирали у тварин на 2-, 3-, 6-, 9- і 12-му місяці життя через 2 години після ранкової годівлі, фільтрували і переносили в анаеробних умовах у буферну суміш. Буферна суміш для інкубації містила слідуючі інгредіенти (г на 1 л): рідини рубця - 300, K2HPO4 ? 0,45, KH2PO4 - 0,45, (NH4)2SO4 - 0,9, NaCl - 0,9, CaCl2 х H2O - 0,12, MgSO4 х 7 H2O - 0,19, цистеїн хлорид - 0,6. Після змішування, 50 мл цієї суміші вносили в інкубаційні посудини в кількості 120 мл і додавали окремо мурашину, оцтову і пропіонову кислоти (кінцева концентрація - 20 мМ). Як джерело азоту додавали сечовину (30 мМ), як джерело енергії - глюкозу (30 мМ). Контролем служили зразки, у які не вносилися названі кислоти. Посудини закривали корками, продували СО2 і інкубували протягом 24-х годин при температурі 38 ?С.
Метою другої серії досліджень було дослідити вплив на процеси метаногенезу: структурних і неструктурних вуглеводів, сірковмісних сполук, карбонових кислот, спиртів, дріжджів і іонофору.
Дослідження цієї серії проведено на трьох бичках-аналогах 6-місячного віку, що утримувались у дослідному господарстві "Чишки". Обробку зразків і інкубацію проводили, як описано в дослідах першої серії. До інкубаційного середовища додавали окремо різні субстрати:
- по 50 мМ/л целюлози, крохмалю, інуліну (в розрахунку на глюкозу чи фруктозу), сахарози, лактози, глюкози, фруктози, лактату, ацетату, пропіонату, а як джерело азоту ? сечовину (30 мМ).
- Na2SO3, Na2SO4 ( по 100 мМ), CrCl3, Na2CrO4, Na2SeO3, ZnCl2, NiCl2, CoCl2, Na2MoO4, MnCl2, CuSO4, FeSO4 (у кінцевій концентрації 10 мМ), як джерело азоту - сечовину (30 мМ), а енергії - глюкозу (30 мМ);
- по 10 мМ/л сульфату амонію, сульфату натрію, сульфіду натрію, відновленого (GSH) або окисленого (GSSG) глутатіону, цистеїну і метіоніну, як джерело азоту -сечовина (30 мМ), а енергії - глюкоза (30 мМ);
- по 10 мМ/л: мурашинової, оцтової, пропіонової, масляної, щавлевої, янтарну, фумарової, молочної, яблучної, цитринової, піровиноградної кислот (натрієві солі), або метанолу, етанолу, пропанову чи бутанолу;
- по 5 або 10 мМ на л натрій фумарату або натрій олеату.
- дріжджі виду Saccharomyces cerevisiae (еквівалентно 100 мг дріжджової маси) або монензин (1 мкМ), а також обидва інгредіенти разом в таких же кількостях, крім цього аналогічні дослідження проведені з деактивованими шляхом кип'ятіння, дріжджовими клітинами.
Після інкубації відбирали зразки рідини і газу для досліджень.
Метою третьої серії досліджень було вивчити вплив амінокислот на ріст бактеріальної маси та продукцію нею метану. Зразки вмістимого рубця відбирали через 2 години після ранкової годівлі. Відстояну рідину центрифугували при 750 g протягом 10 хвилин для відділення інфузорій, а після знову центрифугували при 10000 g протягом 15 хвилин для осадження бактерій. Одержані зразки інкубували як описано в першій серії досліджень. До інкубаційного середовища додавали окремо як джерело азоту аміак або еквівалентно за кількістю азоту (3,5 мМ) кожну із 20 амінокислот (аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин, валін) або суміш цих амінокислот у таких поєднанях: (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Ala, Asn, Asp, Lys), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Arg, Gln, Pro), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + Gly, Ser, Cys), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + гліцин), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + серин), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + цистеїн), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + ізолейцин), (Glu, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr + треонін), як джерело енергії вносили в інкубаційне середовище г
- Київ+380960830922