розділ 2.6.), було обрано метод електрофорезу в 15 % ПААГ.
Рисунок 3.1.2 (треки а, b, c) відображує результати таких досліджень, які дають змогу зробити висновок про те, що за допомогою інсуліну, ковалентно з'єднаного з BrCN-сефарозою, із сироваток крові хворих на ЦД-1 (в нашому випадку від трьох таких осіб) вилучаються білки з різною молекулярною масою; розташування їх в 15 % ПААГ подібне до того, як це відбувається при виділенні ІА на колонці з інсулін-АН-агарозним сорбентом (рисунок 3.1.1).
Рис.3.1.2. Електрофореграма білків сироваток крові від різних хворих на ЦД-1 в 15 % ПААГ після хроматографії цих сироваток на сорбентах з інсулін-сефарозою та білок G-сефарозою
Примітки:
a, b, c - білки, елюйовані з інсулінового сорбенту;
d, e - білки, не сорбовані на білок G-сефарозі;
f, g, h - білки, сорбовані на білок G-сефарозі;
i - стандартна суміш білків з різною молекулярною масою: овотрансферин - 78,0 kDa, альбумін бика - 66,0 kDa, овальбумін - 43,0 kDa, карбоангідраза - 30,0 kDa, 17,0 kDa, цитохром С - 12,0 kDa.
Хроматографічний розподіл БЗІ на сорбенті з BrCN-сефарозою з приєднаним до неї білком G призвів до відокремлення білків, які за молекулярною масою можуть бути ідентифіковані, як окремі ланцюги IgG (рисунок 3.1.2, треки f, g) від інших БЗІ (рисунок 3.1.2, треки d, e).
Цими дослідами показано, що вміст білка в окремих фракціях БЗІ, за умов однотипної постановки хроматографічних та електрофоретичних досліджень, різний, в залежності від того, з сироватки крові якого хворого на ЦД їх одержали.
Подальша робота з розподілу білків сироватки крові від 65 донорів (V=100 мл) та 27 хворих на ЦД (V=25 мл) зазначеним вище методом поетапної хроматографії проводилась з використанням рідинного хроматографа "Bio Rad". На рисунку 3.1.3 представлено профілі елюції білків, що зв'язуються з інсуліном + BrCN-сефароза (пік 2 на обох графіках) та рехроматографія їх на сорбенті з білком G + BrCN-сефароза (піки 3, 4 на графіках А і В).
Постановка цих дослідів дала змогу відокремити фракції, які містять ІА та ІАА (пік 4), від інших білків, які з'єднуються з інсуліном але не сорбуються на білку G пришитому до BrCN-сефарози.
Після порівняння обох графіків дійшли висновку, що розподіл білків сироваток крові здорових людей і хворих на ЦД на цих сорбентах дуже схожий і відрізняється тільки кількісним вмістом білка в кожній фракції, що може бути обумовлене особливостями вихідного матеріалу.
Всі фракції, елюйовані з інсулінового сорбенту, як і рехроматографовані на сорбенті з білком G, також аналізували методом електрофорезу в 15 % ПААГ, як і в попередніх дослідах (рисунок 3.1.4). Слід відмітити, що електрофореграми білків з інсулінового сорбенту (трек а), отримані в цьому досліді, подібні відображеним на рисунках 3.1.1 та 3.1.2.
Застосування BrCN-сефарози з приєднаним білком G дало змогу розподілити елюати з інсулінового сорбенту на дві фракції. Одна з них, за всіма ознаками, належить до білків імуноглобулінової природи; це можуть бути залишки важких і легких ланцюгів IgG з молекулярною масою близько 60 та 30 kDa, а до складу другої фракції входять інші БЗІ.
Електрофореграми білків, здатних зв'язуватись з інсуліном, але не реагувати з білком G (який має властивість з'єднуватись з Fc-фрагментом IgG), налічує значну кількість смуг, найвиразніша з яких розташована в зоні білків з молекулярною масою, притаманною альбумінам (66 kDa). З деякими припущеннями можна вважати, що ще одна смуга, розташована над альбуміновою зоною, відповідає зоні трансферину (78 kDa). З даних літератури відомо, що у хворих на ЦД саме ці білки підлягають змінам у кількісному відношенні [69]. Можна також припустити, що окрему групу БЗІ складають фрагменти ?-субодиниць інсулінового рецептора, які мають молекулярну масу біля 70 кДа.
Рис. 3.1.3. Розподіл білків сироваток крові донорів (А) та хворих на ЦД (В) методом афінної хроматографії на хроматографі "Bio Rad"
Примітки:
1- Білки, які не зв'язалися з інсуліновим сорбентом (трансфузат);
2- Білки, які зв'язалися з інсуліновим сорбентом (елюати з інсулінового сорбенту);
3- елюати з інсулінового сорбенту, які не зв'язались з білком G;
4- білки елюйовані з сорбенту білок G+BrCN 4B сефароза (антитіла до інсуліну)
78,0
66,0
43,0
30,0
17,0
12,0
a b c d
Рис. 3.1.4. Електрофореграма білків сироваток крові хворих на ЦД-1 в 15 % ПААГ після поетапної афінної хроматографії їх на приладі "Bio Rad" з використанням сорбентів інсулін + BrCN-сефароза та білок G + BrCN-сефароза
Примітки: a - білки, елюйовані з інсулінового сорбенту; b - білки, не сорбовані на білок G-сефарозі; с - білки, сорбовані на білок G-сефарозі; d - стандартна суміш білків з різною молекулярною масою: овотрансферин - 78,0 kDa, альбумін бика - 66,0 kDa, овальбумін - 43,0 kDa, карбоангідраза - 30,0 kDa, 17,0 kDa, цитохром С - 12,0 kDa.
Що стосується інших БЗІ, які не сорбуються на білку G, то ідентифікація їх та визначення вмісту в сироватці крові людей становить задачу майбутніх досліджень. Безумовно, для висновку щодо належності до певного типу білків окремих смуг у всіх представлених електрофореграмах необхідні додаткові дослідження їх і перш за все - імуноблотинг з використанням, наприклад МКА до альбуміну, трансферину, окремих фрагментів імуноглобулінів (Fc, Fab) та до інших білків.
Враховуючи те, що значна частина виділених інсулінзв'язуючих білків за всіма ознаками належить до ІА та ІАА, які відіграють суттєву роль при різноманітних патофізіологічних станах, ми вважали за доцільне дослідити їх більш детально. Все це спонукало нас до розробки власного методу гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення антитіл до екзогенного та ендогенного інсуліну в сироватці крові людей. В подальшому цей метод планувалось використати для визн