РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Організми.
В роботі використовувалися такі штами дріжджів: P. guilliermondii – АТСС 9058 -
штам дикого типу; штами генетичної лінії L1, L3, L4. Мутанти RG21(ATCC 201910),
9-D303- обидва з блокованою ГТФ-циклогідролазою ІІ. Мутанти LV381, LV107,
LV158, LV 461, LV 462, LV 463, LV 464, LV 465, LV 466 із порушеною регуляцією
біосинтеза РФ та метаболізма заліза (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Штами дріжджів P. guilliermondii, що використовувались в даній роботі.
Штам
Генотип
Походження
ATCC9058
Дикий тип
[1, 132]
L1
MAT+ ade2-19
[1, 132]
L2 (ATCC201911)
MAT - his-17
[1, 132]
L3
MAT+ metX-1
[1, 132]
L4
MAT- cytX-1
[1, 132]
RG21(ATCC201910)
MAT- his-17 rib1
[7]
9D303
MAT+, ade2-19, rib1-86
[7]
LV381
MAT – hit1-1 his-17
[5]
LV107
MAT + rib80-22 arg-1
[3]
LV158
MAT - rib81-131 his-17
[4]
LV 461
MAT - red1-2 ade2-19
дана робота
LV 462
MAT - red2-32 his-17
дана робота
LV 463
MAT - red3-26 ade2-19
дана робота
LV 464
MAT - red4-37 ade2-19
дана робота
LV 465
MAT - red5-4 ade2-19
дана робота
LV 466
MAT - red6-8 ade2-19
дана робота
Для селекції та ампліфікації плазмід здійснювали трансформацію бактерійних
штамів E. coli DH5б (lacZДM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK-, mK+),
supE44, relA1, deoR, Д(lacZYA-argF)U169), C600 (thi-1, thr-1, leuB6, lacY1,
tonA21, supE44), а також РФ-залежного ribA802-81 (з блокованою
ГТФ-циклогідролазою ІІ).
2.2. Умови культивування
Дріжджові штами вирощували при 28oС у багатому середовищі (YPD: 1% дріжджовий
екстракт, 1,5% пептон, 2% сахароза [133]) або модифікованому середовищі
Беркгольдера, що містило в 1 л 20 г сахарози (або глюкози), 1 г сечовини (або 3
г (NH4)2SO4), 0,5 г KH2PO4, 0,2 г MgSO4 х 7Н2О, 0,2 г СаСI2 x 6H2O, 1 мкг
біотину і суміш мікроелементів [134]. Використовували середовища з оптимальним
для росту - 0,2 мг/л (3,60 mM) і низьким - 0,01 мг/л (0,18 mM) вмістом заліза.
Залізо додавали у вигляді солі Мора. Очищення середовищ від металів проводили
за допомогою 8- гідроксихіноліну за методом Уорінга і Веркмана [135]. При
вирощуванні ауксотрофних мутантів вносили відповідні фактори росту – аденін,
аргінін, гістидин, цитозин (40мг/л), метіонін (25 мг/л), РФ (200 мг/л).
Бактерійні штами вирощували при 37оС на багатому (LB), або мінімальному (М9)
середовищах, [133]. Для селекції плазмідовмісних бактерій використовували
ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Рибофлавінзалежні штами E. coli вирощувалися
на середовищі, котре містило РФ (50 мг/л). Агаризовані середовища як для
бактерійних, так і для дріжджових штамів містили 2% агар. Середовища
стерилізували автоклавуванням.
2.3. Генетичні методи.
Отримання гібридів та основні принципи гібридологічного аналізу описані в
роботах Сибірного і Шавловського [1, 132].
Для конструювання і ампліфікації рекомбінантних плазмід використовували штам Е.
соli DH5б (Thr-, Leu-). Виділення плазмідної ДНК з клітин Е. соli здійснювали
швидким лужним методом Бірнбоім і Долі [136]. Електрофоретичне розділення
фрагментів ДНК проводили в агарозних гелях з концентрацією агарози 0,8–1 %.
Умови електрофоретичного розділення: напруженість електричного поля 5В/см в
буфері ТАЕ: 0,04 трис-ацетат, 0,002 М ЕДТА, рН 8,0. Виділення необхідних
фрагментів ДНК з гелю здійснювали методом електроелюції [136]. Фарбування ДНК
проводили в розчині етидію броміду (4 мкг/мл) протягом 10 хв.
Рестрикцію і лігування плазмідної ДНК проводили за загально- прийнятими
методами [136]. Концентрацію ДНК визначали спектрофотометрично при 260 нм.
Трансформацію клітин дріжджів P. guilliermondii проводили літієвим методом
[137]. Електротрансформацію бактерій та дріжджів здійснювали за допомогою
електропоратора марки Gene Pulser II фірми “Bio-Rad” (США). Загальну геномну
ДНК з дріжджів P. guilliermondii виділяли за модифікованим методом [136],
ампліфікацію мутантного алеля rib1-86 та структурної частини гена RIB1 із
геномної ДНК відповідних штамів P. guilliermondii проводили за допомогою
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), використовуючи Gen Amp PCR System 9700
фірми Applied Biosystems.
Секвенування ДНК виконано в лабораторії проф. К.Філпот (США) за допомогою АВІ
автоматичного секвенатора моделі 373А. Пошук генів гомологів та порівняння їх з
секвенованими фрагментами проводили за допомогою програм BLAST i ClustaiW 1.8
(доступні онлайн за адресами: http://www.ncbi.nlmnih.gov/BLAST/index.html i
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multialighn/html). Використані в роботі
сконструйовані на основі плазміди p19R1 фрагменти ДНК описано у відповідних
розділах. Плазміда р19R1 є похідною плазміди pUC19 [138] , яка містить фрагмент
Sal1 (2,1 тпн) хромосомної ДНК, що несе RIB1 ген ( ГТФ-циклогідролаза II). Для
аналізу РНК клітини вирощували до середньої логарифмічної фази в синтетичному
середовищі із необхідними добавками та відповідним вмістом заліза. Загальну РНК
екстрагували з клітин як описано в [139]. Для Нозерн гібридизації РНК
денатурували з формамідом, розділяли в 1,5% агарозному гелі з формальдегідом та
наносили на нейлонові мембрани (Hybondtm –N+, Amersham). Проби синтезували за
допомогою ПЛР та мітили 32Р радіонуклідом за допомогою (random priming kit,
Gibco – BRL). Нозерн гібридизацію проводили за [140]. РНК гібридизували в за
допомогою Autoblot (BellcoGlass, США) при -70 оС на протязі 48 годин. Відносну
кількість мРНК визначали денситометрично за допомогою прграми Scion Image
version 4.0.2 фірми Scion Corporation . В якості контролю кількості нанесеної
РНК використовували рРНК, яку детектували за допомогою бромистого етидію.
2.4. Аналітичні методи.
Біомасу дріжджів визначали турбідиметрично на фотоелектроколориметрі