РОЗДІЛ 2
Матеріали І методи ДОСЛІДЖЕНь
2.1. Матеріали і обладнання
Для виконання дисертаційної роботи використано наступне обладнання: центрифуги:
„Eppendorff 5417R” („Eppendorff”, Німеччина), „Microspin 24S” („DuPont”, США),
рН-метр „Beckman Ф31” („Beckman”, США), ампліфікатор „Proteus” („Helena
BioSciences”, Велика Британія), прилад для напівсухого електропереносу „Trans
Blot SD” („Bio-Rad”, США) та інше.
Олігонуклеотидні праймери СR763, CR 764, CR 765 синтезовано MWG Genomic Company
(Велика Британія).
У роботі використано поліклональні антитіла: анти-кролячі IgG, конґюговані з
пероксидазою хрону („Promega”, США); набори реактивів: для виділення плазмідної
ДНК „QIAGEN рlasmid рurification kit”, для елюції фрагментів ДНК з агарозного
гелю „QIAquick gel extraction kit” („Qіagen”, Німеччина), для полімеразної
ланцюгової реакції, для рестриктазних та лігазних реакцій („Fermentas”, Литва),
для синтезу кДНК „Zap Express cDNA Synthesis Kit” та конструювання бібліотеки
кДНК „Zap Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit” („Stratagene”, США), для
ECL детекції („Amersham”, Велика Британія), для визначення концентрації білка
Coomassie Protein Reagent („Pierce”, США), для електрофорезу в
поліакриламідному гелі („Bio-Rad”); сорбенти: фосфоцелюлоза Р11 („Whathman”,
Велика Британія), CH-Sepharose 2B („Sigma”, США ), глутатіон-сефароза
(„Amersham”), Dynabeads Oligo (dT)25 („Dynal Biotech”, Норвегія); cередовища:
LB (Луріа-Бертрані) broth, LB-агар („Helena BioSciences”), PDB („Difco”, США);
реактиви: „коктейль” інгібіторів протеаз („Roche”, Німеччина),
2-меркаптоетанол, додецилсульфат натрію, персульфат амонію, трицин („Bio-Rad”),
Coomassie R-250 та G-250, ЕДТА, TEMEД, ДТT („Serva”, США); Tвін-20, Tритон
X-100 („Ferak”, Німеччина), бромистий етидій („Sigma”), агароза („Helena
BioSciences”), фактор Ха („BioLabs”, Велика Британія).
Використано також HCl, NaOH, H2SO4, CH3COOH, NaH2PO4, KH2PO4, СаСl2, MgCl2,
С2Н5ОН вітчизняного виробництва, кваліфікації о.с.ч.
2.2. Плазміди, штами бактерій та грибів, рослинний матеріал
Плазміди для клонування та експресії рекомбінантних білків у клітинах
Escherichia coli: pET23d та pET42а (“Novagen”, США).
Штами бактерій: XL-1-Blue MRF’. Генотип: ?(mcrA)183 ?(mcrCB-hcdSMR-mrr)173
endA1 supE44 thi-1 recAl gyrA96 relAl lac [F’ proAB lacq lac?ZM15 Tn1O(Tetr)].
XLORL. Генотип: ?(mcrA)183 ?(mcrCB-hcdSMR-mrr)173 endA1 thi-1 recA1 gyrA96
relA1 lac [F’ proAB lacq lac?ZM15 Tn1O(Tetr)] Su- лr.
XL-1-Blue. Генотип: supE44 hsdRIT recAl endAl gyrA46 thi relAl
lac-F[proAB+lacI9 lacZAM15 TnlO(tef)].
BL21(DE3) Генотип: F" ompT hsdSs (rb- mb-) gal dsm (DE3).
Культури фітопатогенних грибів Fusarium oxysporum УКМ F-52897, F. solani УКМ
F-50639, Botrytis cinerea УКМ F-16753, Alternaria alternatа УКМ F-16752 та
фітопатогенної бактерії Erwinia carotovora УКМ В-1075 люб’язно надано
Інститутом мікробіології та вірусології НАН України. Культура некротрофного
гриба Heterobasidion annosum люб’язно надана к. с.-г. наук, доцентом Крамарцем
В. О. Культури ооміцетів Pythium dimorphum отримано з Інституту лісових
досліджень (IBL, Варшава, Польща).
В дослідах використано відсортоване життєздатне насіння Pinus sylvestris L.,
отримане з ДП “Буське ЛГ” Львівської області. Насіння ялини (смереки) звичайної
Picea abies (L.) Karst., модрини європейської Larix decidua Mill., дугласії
Pseudotsuga menziesii Franco, туї західної Thuja occidentalis L., вільхи чорної
Alnus glutinosa (L.) Gaerth., акації жовтої Caragana arborescens Lam. люб'язно
надано Львівською державною зональною лісонасіннєвою інспекцією.
Методи роботи з рослинним матеріалом
Умови пророщування насіння. Насіння, промите дистильованою водою, пророщували в
стерильних умовах за температури 26 °С на фільтрувальному папері, змоченому
дистильованою водою, в чашках Петрі, герметично закритих парафіном. Тканини
проростків збирали на 1-7-у добу від початку пророщування, заморожували у
рідкому азоті та зберігали за температури –80 °С до їхнього використання.
Підготовка екстрактів рослинних тканин. Гомогенати тканин отримували механічним
розтиранням у гомогенізаторі Поттера при 4 °С з додаванням лізувального буфера,
що містив 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 150 мМ NaСl, 1% Тритон Х-100 (“Sigma”), 5 мМ
ЕДТА, 1 мМ PMSF та інгібітори протеїназ (“Roche”). Отримані лізати
центрифугували протягом 25 хв при 13000 g, 4 °С. Концентрацію сумарного білка в
надосадовій рідині визначали за методом Бредфорда [45].
2.4. Методи роботи з клітинами Escherichia colі
Середовища для культивування клітин бактерій. Середовище Луріа Бертрані (LB)
містило 1 % бактотриптону, 0,5 % дріжджового екстракту, 1 % NaCl, pH 7,0. NZY
середовище: 0,5 % NaCl, 10 мМ MgSO4, 0,5 % дріжджовий екстракт, 1 % гідролізат
казеїну, pH 7,5. Для приготування LB та NZY агару до відповідного середовища
додавали бактоагар (1,5 %), а для приготування NZY агарози – 0,7 % агарози.
Середовища LB , NZY, LB- та NZY- агар, NZY-агарозу автоклавували при 121 °C
упродовж 15 хв.
Ампіцилін, канаміцин готували в 50 мг/мл концентратах у дистильованій воді,
стерилізували через 0,22 мкм фільтр та зберігали при ?20 °C. Ампіцилін,
канаміцин та тетрациклін використовували в кінцевих концентраціях 50, 50 та
12,5 мкг/мл відповідно.
Отримання компетентних клітин Е. coli. Високоефективні компетентні клітини Е.
coli штамів ХL1-Blue та BL21(DE3) („Stratagene”) одержували як у роботі [18].
Клітини, отримані за даною методикою, використовували для трансформації
лігазною сумішшю або очищеними плазмідами.
У 100 мл LB середовища інокулювали 1 мл нічної культури бактерій, що
культивувалась за присутності 12,5 мкг/мл тетрацикліну (для
- Київ+380960830922