РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
У гастроентерологічному відділені ДОКТМО "Обласна клінічна лікарня ім.М.Калініна" та інфекційному відділенні КЛПУ "Міська лікарня №1" м.Донецька провели поглиблене обстеження 105 хворих на хронічний вірусний гепатит С і 48 практично здорових осіб (контрольна група). Розподіл хворих за віком не відрізнявся від контролю і його наведено в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл обстежених хворих на хронічний гепатит С і контролю за віком
Вік (роки)Хворі з хронічним гепатитом С
n=105Контроль
n=48
Критерій ?2Достовірність (p)16-29абс.328?2=1,99p=0,158%30,47±4,4916,66±5,3730-39абс.2218?2=2,62p=0,105%20,95±3,9737,50±6,9840-49абс.2514?2=0,29p=0,589%23,80±4,1529,16±6,5650 і більшеАбс.267?2=1,35p=0,246%24,76±4,2114,58±5,09УсьогоАбс.10548%100100
В основну групу війшли хворі на хронічний вірусний гепатит С у віці від 16 до 69 років, середній вік (39,43?1,38) років (t=0,41, p=0,677, Mk=0,44, p=0,507, kKW=0,085, p=0,769, відповідно до контролю (38,47?1,51) років не відрізнявся). Серед хворих був 71 пацієнт чоловічої статі (67,61?4,56)% і 34 - жіночої (32,38?4,56)%, в контролі 33 - чоловічої (68,75?6,69)% і 15 - жіночої (31,25?6,69)%, що не різнило групи за статтю (?2=0,0001 p=0,951; ?2=0,01 p=0,920 відповідно).
Контрольну групу склали 48 практично здорових обстежених, результати дослідження яких використовували для порівняння. При обстеженні в них не встановлено захворювань внутрішніх органів та нервової системи під час огляду.
Методи обстеження хворих на хронічний вірусний гепатит С включали в себе клінічні, біохімічні, імунологічні, вірусологічні, сонографічні та морфологічні (морфо-функціональний стан печінки). Біопсію печінки виконували в умовах хірургічного відділення Діагностичного центру ДОКТМО під внутрішньовенним наркозом і сонографічним контролем. Ступінь активності гепатиту класифікували за тяжкістю синдрому цитолізу і запальних змін (інфільтрації) з боку печінкового біоптату, або за співвідношенням АЛТ\АСТ (Губергриц, 2000). Сироватку крові хворих досліджували на наявність анті-HCV, анті-HCVIgM, HBsAg методом ІФА і РНК HCV методом ПЦР. Користувались класифікацією гепатитів Міжнародної робочої групи Всесвітнього конгресу гастроентерологів у Лос-Анджелесі (1994) (WCOG - 1994) [43]. Відбирали хворих, що мінімум за три тижні до надходження до стаціонару не отримували лікування, а імунологічні і біохімічні аналізи проводили до початку лікування.
Відповідно до клінічних, сонографічних, морфологічних методів дослідження встановлено, що зі 105 хворих у 56 обстежених був цироз печінки (53,33?4,86)%, мінімальна активність перебігу захворювання у 42 хворих (40,00?4,78)%, помірна активність - у 52 (49,52?4,87)%, висока активність - у 11 хворих (10,47?2,98)%, порушення обміну білірубіну відмічали у 60 хворих - (57,14?4,82)%.
Обстеження хворих проводили за наступними методами. Дослідження починалося з клінічного аналізу крові. Загальний аналіз крові виконували на цитологічному аналізаторі COBAS EMIRA (фірми La ROCHE, Австрія) (на базі ОКБПЗ) з визначенням кількості еритроцитів, гемоглобіну, кольорового показника, кількості лейкоцитів, лімфоцитів, мононуклеарів, нейтрофілів і швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ).
Забір венозної крові та виділення лімфоцитів проводили з периферичної крові. З крові готували мазки, які фіксували у метанолі та фарбували фарбою Романовського. У мазках підраховували лейкоцитарну формулу на 200 лейкоцитів. У камері Горяєва підраховували загальну кількість лейкоцитів. Враховуючи це, визначали відносний та абсолютний вміст лімфоцитів у крові. Після цього виділені та пораховані живі лімфоцити використовували для проведення тесту для визначення кількості Т- і В-лімфоцитів.
Для визначення методом непрямої імунофлюоресценції поверхневих антигенів фенотипів СD3+, СD4+, СD8+, CD16+, СD22+, суспензію мононуклеарів наносили на предметне скло [10]. Висушені не фіксовані мазки, загорнуті у фольгу, при необхідності зберігали при - (-20)-(-70)° С протягом 3-6 місяців. Вийняті з холодильника препарати доводили до кімнатної температури, розгортали фольгу та опускали у ЗФР на 15-20 с. Залишки вологи зі скла прибирали коливанням. На тильній поверхні скла помічали зону нанесення антитіл. По краях зони вологу старанно усували фільтрувальним папером або електровідсмоктувачем.
Наносили 10-20 мкл антитіл у робочому розведенні, інкубували на льоду у вологій камері 45-60 хвилин. Краплю трусили, змивали струменем ЗФР з пастерівської піпетки, направленої вище ділянки нанесення антитіл протягом 5-10 с, промивали у трьох змінах ЗФР по 5 хвилин. Вологу з тильного боку скла та по краях зони нанесення антитіл прибирали та наносили мічені FІТС антивидові антитіла у робочому розведенні на 45-60 хвил. Після триразового відмивання у ЗФР на скло наносили 50 % розчину гліцерину на 4 % формальдегіду.
Підраховування результатів здійснювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа МИКМЕД-2, використовуючи у якості джерела світла ртутну лампу ДРШ-100 та світлофільтри СС15-3, СС15-6, ОС11-2. Мічені клітини рахували по зеленій флюоресценції клітинної поверхні дифузного або гранулярного типу. Підрахунок проводили відносно 200 клітин із контролем при використовуванні фазово-контрастної мікроскопії по кількості клітин із цитоплазматичною мембраною, яка світиться, більше 1/3 периметру, або з гранулярним свіченням мембрани, чи клітин, що утворили "шапочки" (сарs). Обчислювали відсотковий вміст та абсолютну кількість клітин, які несуть досліджуваний антиген [10, 98].
Імуноглобуліни класів А, М, G у сироватці крові визначали за модифікованою методикою G.Mancini (1965) [241]. Використовували стандартні набори діагностичних моноспецифічних сироваток проти імуноглобулінів людини. Цей метод, заснований на вимірюванні діаметра кільця преципітації, яке утворюється при внесенні досліджуваної сироватки, у лунки, які вирізані у шарі агару, в я