РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Виходячи з мети та завдань, поставлених в роботі, вона була розділена на чотири етапи.
На першому етапі об'єктом дослідження були 104 донори, 107 вагітних та 204 хворих з хронічними захворюваннями печінки. У них визначалась наявність маркерів вірусних гепатитів В та С HВsAg, HВеAg, анти- HВеAg, анти-HВсAgM та G, анти-HВs, anti-HCV, HCVcor, NS4 та NS5 імуноферментним методом з допомогою тест-систем другого покоління. При позитивних результатах у обстежених проводилось біохімічне дослідження: визначення білірубіну, активності амінотрансфераз, загального білку; морфологічне дослідження.
На другому етапі обстежувалися хворі з хронічними вірусними гепатитами (304), що знаходилися на диспансерному та стаціонарному лікуванні в міському гепатологічному центрі. Хворі були піддані комплексному загально-клінічному обстеженню: ретельно вивчено епідеміологічний анамнез, проведено фізикальне обстеження, комплекс клінічних, біохімічних, імунологічних, інструментальних та морфологічних досліджень. Діагноз вірусного гепатиту виставляли згідно з класифікацією, прийнятою на Міжнародному конгресі гастроентерологів (Лос-Анджелес, 1994). Для порівняння було обстежено 22 хворих з HCV-цирозом, всі клас А за Child та 33 хворих з ГГВ (13 - середньоважкий перебіг, 15 - важкий, 5 - фульмінантний).
Ступінь активності печінкового процесу враховували за даними клініко-лабораторного та морфологічного обстеження [243].
Згідно з сучасною клініко-лабораторною класифікацією синдромів хронічних гепатитів, яка базується на патофізіологічному та патоморфологічному принципах, проводилась оцінка основних біохімічних синдромів - цитолізу, холестазу, печінково-клітинної недостатності [46].
Синдром цитолізу оцінювали шляхом визначення активності аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) та аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) уніфікованими методами Райтмана-Френкеля [80], синдром холестазу оцінювали визначенням активності ?-глутамілтрансферази (КФ 2.3.2.2) за швидкістю вивільнення 4-нiтроанiлiну з ?-глутамiлнiтроанiлiду та вмістом білірубіну і його фракцій, які визначали уніфікованим методом Єндрасика-Грофа [80], синдром печінковоклітинної недостатності оцінювали уніфікованими методами за вмістом загального білку (мікробіуретовий метод), білкових фракцій (електрофорез на папері) та величині протромбінового індексу [80].
Стан ліпідного обміну оцінювали визначенням вмісту холестерину та його ліпопротеїнових фракцій уніфікованим методом Ілька та тригліцеридів, кількість яких визначали після екстракції уніфікованим методом по реакції з ацетилацетоном [80].
Вміст заліза в плазмі крові визначали за реакцією з бато-фенатроліном [13, 80].
Кількісне визначення карбонільних груп білків проводили за їх здатністю утворювати гідразони з 2,2-динітрофенілгідразином, які поглинають при 270 та 363 нм [107, 224, 288]. Окислювальну (перекисну) модифікацію ліпідів плазми крові оцінювали за вмістом диєнових кон'югатів, використовуючи здатність супряжених подвійних зв'язків поглинати при 270 нм [39].
В сироватці крові визначали вміст метаболітів оксиду азоту - нітритів та нітратів за реакцією з реактивом Гріса - 0,2% на 12% розчині оцтової кислоти [77, 131], після осадження білків ацетонітрилом. Нітрати попередньо відновлювали до нітритів сумішшю цинкового порошку та розчину аміаку.
В сироватці крові визначали вміст 3-нітротирозину, після осадження білків 70% хлорною кислотою [580]. Аналіз вели методом ВЕРХ (хроматограф HP 1100 "Leonardo"), як описано в роботі K.Honda та співавт. (1999), використовуючи колонку Hypersil BDS C18 125x4 mm 5 мкм та в якості елюента систему, що складається з 50 мМ KH2PO4-H3PO4 (pH 3,0) і 10% (за об'ємом) метанолу. 3-нітротирозин кількісно визначали за його поглинанням при 274 нм. Ідентифікацію 3-нітротирозину проводили порівнянням часу затримки з таким у 3-нітротирозину (фірма (Sigma, США). Межа відкриття - 2,5 нг.
В плазмі крові досліджували вміст сфінгозину відомим методом після екстракції сфінголіпідів з плазми та їх гідролізу [303, 514]. Кількісне визначення сфінгозину проводили методом ВЕРХ (хроматограф HP 1100 "Leonardo") після його дериватизації з орто-фталевим альдегідом використовуючи колонку Hypersil BDS C18 125x4 mm 5 мкм та в якості елюента суміш метанолу з 5 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7,0 (9:1).
Вміст глікозаміногліканів в сироватці крові оцінювали за відомим методом з застосуванням карбазолової реакції [65], а гіалуронову кислоту за карбазоловою реакцією після її виділення шляхом послідовного хроматографування на тонкому шарі целюлози, спочатку в системі етанол-2,5% ацетат кальцію а потім - в системі етанол - 5,0% ацетат кальцію [163].
Ліпідний склад сироватки крові визначали після екстракції ліпідів за методом Bligh, Dyer [66]. Загальний вміст ліпідів визначали за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом [112]. Ліпідний спектр визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40 (Chemapol,Чехія). Нейтральні ліпіди розділяли в системі гексан-диетиловий ефір-мурашина кислота у співвідношенні 16: 4: 0,2 (за об'ємом), фосфоліпіди - в системі хлороформ-метанол-вода у співвідношенні 65:30:5 (за об'ємом) [66]. Ідентифікацію індивідуальних нейтральних ліпідів та фосфоліпідів після їх хроматографічного розділення проводили методом свідків, за допомогою якісних реакцій на холін, етаноламін, серин, сфінгомієлін та за величинами Rf, відомими з літератури [66]. Кількісне визначення фракцій ліпідів після їх хроматографії проводили за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом.
Вміст ?2-мікроглобуліну в сироватці і сечі визначали імуноферментним методом [300, 616] стандартними наборами фірми UBI MAGIWEL (США). Процедура аналізу полягає в зв'язуванні ?2-мікроглобуліну з антитілами (АТ) до ?2-мікроглобуліну, адсорбованими на твердій фазі. Після внесення в лунки ряду стандартів (5, 20, 50, 100 та 200 нг/мл) і проб (100 мкл, розведення проб 1:100), для утворення комплексу анти