РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження хімічного канцерогенезу проведені на 830 нелінійних щурах-самицях і 410 щурах-самцях розплоду віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, які утримувалися на стандартному раціоні.
Індукцію пухлин молочних залоз у щурів-самиць віком 60 діб проводили шляхом внутрішньовенного введення 7,12-диметилбензантрацену (7,12-ДМБА фірми "Fluka et Busch", Швейцарія) одноразово в дозі 3,5мг/100г маси тіла і по 2 мг/100г маси тіла тричі з інтервалом в одну неділю в складі водножирової емульсії. Гепатоми у щурів-самців викликали введенням рer os за допомогою зонду нітрозодиетиламіну (НДЕА) з розрахунку 2мг/100г маси тіла в 0,5мл води 5 разів на тиждень протягом 40 днів.
125 щурів-самиць 2 роки утримувались в зоні аварії на ЧАЕС (м. Чорнобиль) і споживали їжу, забруднену радіонуклідами (200 Бк на добу), зокрема, 134Cs, 137Cs, 90Sr, 239Pu, 241Am та інші. Контрольна група тварин перебувала на звичайному раціоні у віварії ІЕПОР.
На крові дітей, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, проведено дослідження утворення комплексів нітрозогемоглобіну (Hb-NO) в якості маркеру віддалених наслідків дії випромінювання інкорпорованих радіонуклідів в зв'язку з аварією на ЧАЕС. В експериментах використовувалась венозна кров, яка в подальшому досліджувалась як в нативному стані, так і після моделювання з оксидом азоту. Кров стабілізували гепарином або цитратним буфером рН 5,6. Потім до 100 мкл стабілізованої крові додавали рівний об'єм децимолярного фосфатного буферу рН 6,4 і обробляли оксидом азоту. Для генерування NO в зразок крові вносили розраховані об'єми дітіоніту і нітриту натрію на фосфатному буфері. Із отриманих препаратів крові готували зразки рівного об'єму, заморожували при T=77К і проводили дослідження на спектрометрі ЕПР-1307 в режимі низькотемпературної стабілізації в рідкому азоті. Із нативної стабілізованої крові також готували зразки, які заморожували при Т 77К і досліджували методом ЕПР. Визначення інтенсивності сигналу ЕПР зразка проводилось при порівнянні з сигналом ЕПР зразка рубіну.
Мікросоми з тканин печінки і нирок одержували за методом [74], білок визначали методами [75, 76].
Кількісне визначення швидкості генерування супероксидних радикалів-аніонів проводили за окисленням спінового уловлювача - гідроксиламіну - 2,2,6,6-тетраметил-4-оксипіперидину до відповідного стабільного нітроксильного радикала, який реєструвався методом ЕПР:
Реєстрацію нітроксильних радикалів здійснювали методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) при 20оС у спеціальних кварцових кюветах завтовшки 0,5 мм без парамагнетиків. Мікросомальні мембрани включались у реакційне середовище, яке складалось з 2х10-3 моль/л гідроксиламіну, 2х10-4 моль/л НАДФ*Н в 0,05 моль/л фосфатному буфері, рН 7,4, який містив 5х10-4 моль/л диетилентриамінпентаоцтової кислоти. Всі розчини готували на бідистильованій воді, а всі реагенти перекристалізовували.
Спектр ЕПР нітроксильного радикалу є триплетом з фактором спектроскопічного розщеплення g=2,005. Реакція накопичення нітроксильних радикалів у мембранах після включення їх у реакційну суміш проходить лінійно протягом 5 хв. Через певні інтервали часу (40 сек.) проводили послідовну реєстрацію спектрів ЕПР. Будували залежність амплітуди другої компоненти спектра ЕПР нітроксильного радикала від часу. З одержаної залежності розраховували швидкість накопичення нітроксильних радикалів, яка дорівнювала швидкості генерування супероксидних радикалів-аніонів (нмоль/мг білка за хв).
Рівень гідроксильних радикалів оцінювали за допомогою уловлювача, яким був диметилсульфоксид (ДМСО). При його окисленні гідроксильними радикалами утворюються метилові радикали (СН3), продуктом реакції яких з киснем є формальдегід:
(CH3)2-SO + H CH3SOOH + H3
Останній визначали методом спектрофотометрії при довжині хвилі 415 нм на спектрофлуориметрі КСВУ-23 [77].
Стан залізосірчаних білків N - типу електронтранспортуючого ланцюга енергетичної системи мітохондрій оцінювали в зразках органів методом ЕПР при Т 77К.
Вміст окисленої і відновленої форм цитохрому Р-450 ендоплазматичного ретикулуму в органах вивчали методом ЕПР при Т 77 - 4,2К.
Стан молекулярних переносників електронів наднирників оцінювали методом ЕПР при температурі Т 77- 4,2К.
Утворення нітрозильних комплексів негемових залізосірчаних білків в електронтранспортуючих ланцюгах в печінці, нирках і наднирниках реєстрували методом ЕПР при Т 77К. Для цього за допомогою спеціальної методики, яка розроблена в відділі біофізики канцерогенезу ІЕПОР, готували зразки з органів тканин, які і досліджувались методом ЕПР. Сигнали ЕПР реєструвались в вигляді першої похідної лінії поглинання на 3 см радіоспектрометрах РЭ - 1307 і RADIOPAN з високочастотною модуляцією магнітного поля (100 кГЦ) у кварцовому д'юарі при відсутності насичення сигналу ЕПР з фіксованою потужністю випромінювання клістрону.
Визначення активності супероксиддисмутази (СОД) проводили в печінці, нирках та еритроцитах за методикою, яка описана в роботі [78]. Принцип визначення активності СОД базується на відновленні нітротетразолію супероксидними радикалами, які утворюються при реакції між феназинметасульфатом і відновленою формою нікотинаміддинуклеотиду (НАД*Н). Утворення нітрозофармазану, продукту відновлення нітротетразолію, блокується наявністю в пробі СОД. Тому на основі кількісної оцінки нітрофармазану можна визначити активність СОД. Розрахунки проводили за формулою :
де Е - активність СОД;
Ек - екстинція контрольної проби, що не містила СОД;
Ед - екстинція досліджуваної проби.
Активність каталази в тканинах печінки визначали за методом [79] з застосуванням 4% розчину молібдату амонію, 0,003% розчину перекису водню, гліцинового буферу (рН 7,8). Реакція розпочиналась введенням 0,1 мл досліджуваного матеріалу і 0,2 мл 0,03% ро