ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И
КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для решения поставленных задач исследования проводились в трех основных
направлениях:
а) изучение влияния низких температур на некоторые показатели функциональной
активности эмбриональных клеток;
б) изучение механизмов взаимодействия криоконсервированных эмбриональных клеток
с организмом реципиента в ранние и отдаленные сроки после трансплантации в
эксперименте при модельной патологии;
в) изучение влияния криоконсервированных эмбриональных клеток на основные
метаболические показатели организма при сосудистой патологии, в том числе
офтальмологической, определение клинической эффективности трансплантации
криоконсервированных эмбриональных клеток при лечении сосудистой патологии
органа зрения.
Препараты приготавливали из эмбрионов 8-9 недель гестации по описанному ниже
методу и подвергали криоконсервированию.
Донорами эмбрионов были здоровые женщины, которые поступили в гинекологические
отделения больниц для искусственного прерывания бере-менности с предварительным
обследованием на отсутствие гонококковой и ВИЧ-инфекций, сифилиса и вирусных
гепатитов В и С. Противопоказаниями для использования эмбрионов при
производстве препаратов было наличие в анамнезе женщины-донора сифилиса,
гонореи, туберкулеза, гепатитов, цитомегаловирусной инфекции и токсоплазмоза и
перенесенных во время беременности кори и краснухи.
Эмбрионы и плоды не менее 6 недель гестации получали с помощью специальных
приборов для вакуумэкстракции согласно методу (Грищенко В.И. и соавт., 1991
г.). Полученный эмбрион переносили во флакон одноразового использования,
который содержит стерильный физиологический раствор с антибиотиком. Материал
мог сохраняться на протяжении времени транспортировки в лабораторию в течение
нескольких часов на льду в термоизолированной таре при постоянной температуре
от 0 до 4°С.
Получение гемопоэтических, нейрональных эмбриональных клеток и препарата
«Гемонейронал» проводили в условиях стерильного бокса при комнатной температуре
по методике, описанной в методических рекомендациях, утвержденных
координационным центром трансплантаций органов тканей и клеток МОЗ Украины
[40].
Для изучения препаратов использовали цитологические и цитохимические методы,
которые дают информацию о морфологической характеристике исследуемых клеток, их
зрелости, жизнеспособности и пролиферативной активности. Мазки производили без
отмывания клеток для того, чтобы сохранить и изучить весь клеточный состав
препарата. Для обзорного исследования применяли окраску препаратов
гематоксилином и эозином по общепринятой методике, дающую общую характеристику
исследуемых клеток. Для изучения накопления гликогена в клетках эмбриональной
печени использовали ШИК-реакцию (шифйодная кислота) [114]. Элементы
соединительной ткани в препаратах выявляли методом аллохромного окрашивания
соединительной ткани по Лилли [114]. Препараты нервных клеток окрашивали по
методу Ниссля [173]. При применении этой методики глыбки тигроида, ядерная
оболочка и ядрышки нервных клеток окрашиваются в интенсивно синий или
фиолетовый цвет, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток – бледно-синяя.
Использовали также импрегнацию нервных клеток по методу Гримелиуса, в
результате которой в цитоплазме нервных клеток выявляются гранулы черного
цвета. Для дифференцирования клеток нейроткани использовали методики
дифференцированного выявления нейронов и глии по методу Альцгеймера-Ниссля в
модификации Д.С. Саркисова [172].
Количественное содержание в криоконсервированном и нативном препаратах клеток,
экспрессирующих CD34, CD11a, CD11b, CD18, CD62L, определяли методом мембранной
иммунофлюоресценции, используя соответствующей специфичности моноклональные
антитела [226]. Для определения полипотентных клеток-предшественников
использовалась следующая методика: клетки отмывали раствором Хенкса два раза,
контроль концентрации живых клеток проводили в камере Горяева с 0,2% трипановым
синим. Затем клетки в объеме 50 мкл вносили в центрифужные пробирки, добавляли
5 мкл, к примеру, CD34 и инкубировали 45 минут при плюс 4оС. Затем клетки
дважды отмывали раствором Хенкса, к осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл
F(ab)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных в
соотношении 1:100 на растворе Хенкса с 0,5% желатина, суспендировали и
инкубировали 30 минут при плюс 4оС и дважды отмывали раствором Хенкса. В
качестве отрицательного контроля использовался препарат, подготовленный
аналогичным образом, за исключением того, что вместо моноклонального антитела
клетки обрабатывали раствором Хенкса. Производился подсчет общего числа клеток
в поле зрения при световом микроскопировании, затем микроскоп переводили в
режим флюоресценции и производили подсчет светящихся клеток.
Активность ферментов энергетического обмена гексокиназы (КФ2.7.1.1),
6-фосфофруктокиназы (КФ2.7.1.11), пируваткиназы (КФ2.7.1.40),
лактатдегидрогеназы (КФ1.1.1.27), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ1.1.1.49),
НАДФ-зависимой изоцитратде-гидрогеназы (КФ1.1.1.42) определяли при помощи
спектрофотометрических методов, в основе которых лежит использование
сопряженных систем окисления или восстановления никотинамидных коферментов [4].
Изменение активности цитохром с-оксидазы определяли по скорости окисления
ферментов восстановленного цитохрома С в расчете на 1 мг белка.
Интенсивность аэробного и анаэробного гликолиза в клетках оценивали по
накоплению в образцах молочной кислоты при культивировании 107 кл/мл в течение
одного часа при 37оС [4].
Колониеобраз
- Київ+380960830922