РОЗДІЛ 2
методи ЗДІЙСНЕНИХ НАУКОВИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Виявлення анти-HCV
Наявність анти-HCV визначали за допомогою тесту HCV-UBI а також доповнюючим
тестом LiaTek HCV III.
HCV UBI /EIA/ 4.0 фірми Organon Teknika
HCV UBI /EIA/ 4.0 фірми Organon Teknika це імуноензимний якісний тест, що дає
змогу виявляти анти-HCV класу IgG. Виявлення анти–HCV базується на використанні
як структурних (C 22), так і неструктурних антигенів (C 33C, C-100-3, NS5), що
містяться у відповідних фрагментах геному HCV.
LiaTek HCV III фірми Organon Teknika
Тест типу Line Immunoassay доповнюючий, що підтверджує наявність антитіл
анти-HCV. Складається з шести антигенів, отриманих синтетично (продукт
виступаючого епітопу з регіону кодуючих неструктурних білків: E2/NS1, NS3, NS4,
NS5, а також 2 епітопів зі структурного білка серцевинного регіону, що
позначається C1, C2). У цьому тесті антигени HCV у стандартній концентрації
нанесені окремо на нейлонову плівку у вигляді поперечних смуг до довгої осі
полоски, злученої з контрольною
3+ 1+ +/- C1 C2 E2/NS1 NS3 NS4 NS5
Рис. 2.1. LiaTek HCV III
полоскою (людські IgG 3+, 1+, +/-), яка служить критерієм оцінки ступеня
розгонки. Попри порівняння зі зразками, результат реакції оцінювали як
невизначений (+/-) або позитивний у межі 4- ступенів (від 1+ дo 4+). Позитивний
результат відповідав одній смузі світіння (2+) чи будь-якій іншій якісній і
кількісній комбінації, що перевищує ці показники.
Teсти були виконані на апаратурі Organon Teknika Microwell system.
2.2. Oцінка біохімічних тестів захворювань печінки
AлАТ – активність аланінамінотрансферази визначали за допомогою кінетичного
методу IFCC з використанням реактивів фірми Roche. Дослідження виконували на
аналізаторі COBAS EMIRA фірми Roche. Референційна вартість: дo 41 од./I.
AspAT – активність аспартатамінотрансферази визначали за допомогою кінетичного
методу IFCC з використанням реактивів фірми Roche. Дослідження виконували на
аналізаторі COBAS EMIRA фірми Roche. Референційна вартість: do 40 од./I.
GGTP - активність гама-глутамілтрансферази визначали за допомогою кінетичного
методу IFCC з використанням реактивів фірми BioSystems. Дослідження виконували
на аналізаторі COBAS EMIRA фірми Roche. Референційна вартість: у чоловіків
16-86 од./I, у жінок 12-48 од./I.
ALP - активність лужної фосфатази визначали за допомогою кінетичного методу
IFCC з використанням реактивів фірми BioSystems. Дослідження виконували на
аналізаторі COBAS EMIRA фірми Roche. Референційна вартість: у чоловіків до 115
од./I у жінок до 105 од./I.
концентрацію загального білірубіну визначали колориметричним методом з
використанням реактивів фірми Roche. Дослідження виконували на аналізаторі
COBAS EMIRA фірми Roche. Референційна вартість: 0,2-1,2 мг/дл.
сироватковий білок виділяли електрофоретично нa агаровому гелі з використанням
реактивів CORMAY GEL PROTEIN 100 фірми CORMAY. Аналіз протеїнограм виконували
на денситометрі DS-3 фірми CORMAY.
Концентрацію загального білка визначали біуретовим методом. Референційна
вартість:
* загальний білок 6,4-8,3 г/дл;
* альбумін 53-66 % 3,89-4,85 г/дл;
* б-1 глобулін 2-5,5 % 0,15-0,40 г/дл;
* б-2 глобулін 6-12 % 0,44-0,88 г/дл;
* в-глобулін 8-15 % 0,59-1,10 г/дл;
* г-глобулін 11-21 % 0,81-1,54 г/дл.
рівень протромбіну визначали шляхом вимірювання часу рекальцинації плазми після
додавання тканинного тромбопластину з використанням набору реактивів фірми
Roche. Долідження виконували на апараті K3002 OPTIC фірми Kselmed. Референційна
вартість: 80-120 %.
2.3. Визначення нуклеїнових кислот HCV-РНК
HCV-РНК визначали кількісним тестом COBAS AMPLICOR HCV, v2.0 фірми Roche а
також кількісним тестом COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, v2.0. фірми Roche згідно з
інструкцією фірми.
Ці тести включають п’ять етапів:
приготування проб через ізоляцію HCV-РНК із сироватки чи плазми шляхом
хімічного лізису вірусних часток i знищення РНК спиртом;
зворотна транскрипція шуканої РНК з метою отримання комплементарної ДНК
(кДНК);
ампліфікація шуканого фрагменту кДНК методом ПЛР з використанням праймерів KY78
i KY80, що визначають фрагмент 244 нуклеотидів всередині найбільш
консервативного регіону 5` - нетрансляційного у геномі HCV;
реакція зворотної транскрипції та ампліфікації виникає при наявності
рекомбінованого термостабільного ензиму: Thermus thermophilus ДНК полімерази
(rTth pol), яка при наявності іонів Mn2+ займає обидві активності, що дозволяє
перебігати обом реакціям у тій же суміші реагентів;
гібридизація продуктів ампліфікації до шуканих фрагментів специфічних
олігонуклеотидів;
колориметричне виявлення комплексів з продуктами ампліфікації.
2.4. Морфологічне дослідження печінки
Черезшкірну біопсію печінки виконували методом Menghiniego з використанням
одноразових наборів HEPAFIX 1,4 фірми Braun після попереднього місцевого
знеболення 1 % розчином лідокаїну. Отримані біоптати консервували у 10 %
формаліні. Морфологічну оцінку біоптатів злійснював професор, габілітований
доктор медицини Юліан Столярчик, керівник кафедри патологічної фізіології
Ґданської медичної академії.
Біоптати печінки оцінювали гістопатологічно з використанням традиційної
класифікації або модифікованої шкали Шеуера, що виражає активність змін
(grading), а також фіброз (staging) у ступенях [107, 108]:
0 – відсутність
1 – незначний
2 – помірний
3 – середній
4 – значний
2.5. Визначення типів HCV
Серотипування
Серотипи визначали шляхом імуноензимного тесту MUREX HCV Серотипing 1-6 Assay,
у якому використовували синтетичні пептиди регіону NS4, зв’язані зі сталою
фазою.
Генотипування
Генотип HCV визначали тестом INNO-LiPA HCV II фі