РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ, МЕТОДИ ТА УМОВИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Поданий у дисертації експериментальний матеріал одержано в результаті досліджень, які проводили впродовж 1996 - 2002 років у лабораторії технічної мікробіології Південного філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН і впродовж 2002 - 2003 років у лабораторії екології ґрунтових мікроорганізмів Інституту агроекології та біотехнології УААН.
2.1. Об'єкти досліджень
Об'єктами досліджень були нові штами діазотрофів, що виділяли з кореневої зони рослин, відібраних за кращими фенотиповими показниками з природних фітоценозів і високопродуктивних агрофітоценозів різних географічних і грунтово-кліматичних зон, а також і штами, одержані з інших наукових установ з метою розробки їх препаративних форм та випробування в Державній мережі дослідів з біопрепаратами (табл. 2.1)
Таблиця 2.1
Штами мікроорганізмів, одержані з наукових установ
Вид
мікроорганізмуУстанова - оригінатор Автори штаму123Agrobacterium radiobacter штам 204ПФ ІСГМ УААНШерстобоєв М.К., Патика В.П.
та їн.Enterobacter aerogenes
штам 30-фПФ ІСГМ УААНЄрмоліна А.В., Патика В.П.
та ін.Enterobacter nimipressuralis штам 32-3ПФ ІСГМ УААНЧайковская Л.О., Мельничук Т.М.Flavobacterium sp.
штам L-30 (Л-30)ВНДІСГМ РАСГНВасюк Л.В.Bradyrhizobium japonicum 2190 (штам 634б)ВНДІСГМ РАСГНеталон СНГ (колектив авторів)Bradyrhizobium japonicum штам M-8ПФ ІСГМ УААНТолкачов М.З., Патика В.П.,
Каменева І.О. та ін.Rhizobium leguminosarum штам П-2ПФ ІСГМ УААНКусмарцева Л.О., Патика В.П., Толкачов М.З. та ін.Rhizobium leguminosarum штам H-7ПФ ІСГМ УААНТолкачов М.З.123Azotobacter vinelandii
штам 10702ПФ ІСГМ УААНШерстобоєв М.К.Azotobacter chroococcum штам 21 ІСГМ УААНБерестецький О.О.,Мочалов Ю.М.Azotobacter chroococcum штам 20ІМВ НАНУАнтипчук А.Ф., Рангелова В.М. та ін.Bacillus subtilis
штам 26 DІМВ НАНУСмирнов В.В., Рева та ін.
Рослинним об'єктом досліджень була - озима пшениця різних сортів. В окремих дослідах застосовували яру пшеницю сорту Миронівчанка, сою, ярий та озимий ячмінь.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Мікробіологічні методи. Високоактивні за фіксацією молекулярного азоту штами діазотрофів виділяли в чисту культуру з ізольованих з кореневої зони рослин комплексів мікроорганізмів, які відрізнялись високим рівнем ацетиленредукції. Зразки коренів рослин і грунту для виділення штамів діазотрофів відбирали з природних цілинних фітоценозів і високопродуктивних агрофітоценозів різних географічних і грунтово-кліматичних зон, керуючись рекомендаціями, що наведені в посібнику "Большой практикум по микробиологии" [12].
Виділяли азотфіксуючі штами бактерій методом скринінгу [6], а також запатентованим нами методом, суть якого полягає у створенні елективних умов вирощуванням рослин на кремнекислих пластинках, просочених розчином мінеральних солей фосфору та магнію, де джерелом енергетичних і ростових речовин для мікроорганізмів є лише продукти фотосинтетичної діяльності проростка, що виділяються коренями, а джерелом азоту для рослини - фіксований азот повітря діазотрофами, популяція яких утворюється на її коренях.
Морфологію бактеріальних клітин вивчали в живій однодобовій культурі за допомогою фазово-контрастної мікроскопії і мікроскопу LABOVAL 4 фірми Carl Zeiss Jena, а також за допомогою електронного мікроскопу "TESLA" BS - 540. Препарати для електронномікроскопичних досліджень готували, фіксуючи культуру бактерій у парах оксиду осмію.
Культуральні і фізіолого-біохімічні властивості виділених штамів бактерій вивчали за методами, які використовуються як ідентифікаційні тести і наведені в практикумах [6,12]. Аеробні бактерії, які утворюють ендоспори, додатково тестували за посібником ІМВ НАНУ [138]. За встановленими ідентифікаційними ознаками ідентифікували нові штами бактерій, використовуючи 9-те видання визначника Bergey [286], а уточнювали назву родів згідно нових опублікованих даних, одержаних за допомогою сучасних методик визначення таксономічної належності мікроорганізму [271,272,299].
Нітрогеназну активність комплексів мікроорганізмів, чистих культур штамів діазотрофів та ґрунтового угруповання кореневої зони рослин визначали методом ацетиленредукції за допомогою газового хроматографу марки "Chrom-5" з іонізаціонно-полум'яним детектором [38,323]. Хроматографічні колонки 90 х 0,6 см заповнювали силікагелем марки МСМ фракції 0,25 мм. Температура термостату 100оС. Гелій використовували як газ-носій, водень і повітря - для забезпечення горіння пломеню у детекторі, які пропускали через колонки зі швидкістю, відповідно, 40, 40 і 500 см3/ хвилину.
Дводобові культури штамів-ізолятів для визначення їх нітрогеназної активності одержували в 20 мл напіврідкого (0,3% агару) середовищі Федорова - Калінінської в 5-разовому повторенні і впродовж 2 годин інкубували з 2% ацетилену при 30оС [94]. Як джерело вуглецю в середовищі використовували глюкозу, але в окремих випадках для висвітлення оптимального для азотфіксації джерела вуглецю, визначали активність ацетиленредукції також і на різних органічних солях натрію, які можуть бути найбільш вірогідними, ніж глюкоза, джерелами енергії і вуглецю в природних умовах, а для окремих видів діазотрофів є таксономічною ознакою.
Здатність нових штамів асимілювати молекулярний азот в асоціації з озимою пшеницею визначали при вирощуванні інокульованих і не інокульованих (контрольних) рослин по 1 рослині в 50 мл мінерального середовища Виноградського без азоту і вуглеводів (повторність п'ятиразова), впродовж 3 тижнів, з подальшим аналізом сумарного накопичення загального азоту в середовищі і фітомасі методом К'єльдаля [52]. За різницею накопичення азоту мікробно-рослинними асоціаціями в дослідних і контрольних варіантах визначали активність асоціативної фіксації азоту повітря.
Спектр дії антагоністичних властивостей досліджених штамів мікроорганізмів визначали за посібником "Микология и фітопатология" [14], викорис